“糾纏”在一起的DNA被壓縮在細(xì)胞核內(nèi)，想對(duì)核內(nèi)復(fù)雜的環(huán)境進(jìn)行觀察是個(gè)困難的事情，整理分享一篇用超分辨顯微鏡觀察染色質(zhì)的文章，具體內(nèi)容如下：

細(xì)胞核內(nèi)DNA并不獨(dú)立自由的存在，而是以特定的方式壓縮：DNA纏繞組蛋白形成核小體（nucleosome）；串聯(lián)的核小體進(jìn)一步壓縮成染色質(zhì)（chromatin）；細(xì)胞分離時(shí)，染色質(zhì)會(huì)壓縮成染色體

用核酸染料（SYTOX Green或DAPI）對(duì)核內(nèi)進(jìn)行染色，SIM超分辨進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)核內(nèi)DNA呈海綿狀，有的地方DNA密集（白色區(qū)域），有的地方?jīng)]有DNA（黑色），作者將DNA密集區(qū)定義為CD（chromatin domain染色質(zhì)區(qū)域），將沒有DNA的黑色區(qū)域定義為IC（inter－chromatin compartment 染色質(zhì)間隙），IC與核孔相連

染完DNA“染”組蛋白用于反映染色質(zhì)：DNA和組蛋白共定位；除了在固定細(xì)胞上看染色質(zhì)，為了排除固定對(duì)細(xì)胞核狀態(tài)的影響，又在活細(xì)胞上看了染色質(zhì)狀態(tài) – 依然是IC與CD黑白相間的海綿狀

進(jìn)一步用EU摻入法標(biāo)記出RNA，發(fā)現(xiàn)RNA和DNA“互斥”，暗示RNA分布在IC區(qū)

超分辨看完又用電鏡看細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)（和SIM想法，在電鏡圖上黑色反映高密度區(qū)，黑色的是染色質(zhì)）

對(duì)電鏡圖進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)電鏡圖和SIM圖觀察出的染色質(zhì)狀態(tài)一致

作者以“麻麻咧咧”的細(xì)胞核SIM超分圖為根據(jù)地，觀察各種已知的變量在CD區(qū)和IC區(qū)的分布，首先是看TAD（topologically associating domains）：TAD是染色質(zhì)折疊出的空間結(jié)構(gòu)，通過測(cè)序技術(shù)3C／Hi－C，能找到DNA片段上相關(guān)序列

首先看了一個(gè)已知的在X染色體上的TAD位點(diǎn)，F(xiàn)ISH標(biāo)定出了TAD（紅色點(diǎn)），分析TAD和CD空間關(guān)系發(fā)現(xiàn)兩者相鄰、嚴(yán)密契合

看其他TAD，依然是分布在CD區(qū)周圍

接下來作者看了各種組蛋白修飾、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白、RNA相關(guān)蛋白在CD或IC的分布。首先，作者自己制定了一套量化標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)蛋白在IC－CD之間的分布情況分為7級(jí)：在IC定義為1，在CD定義為7

可見異染色質(zhì)、沉默基因相關(guān)組蛋白分布在CD區(qū)，離IC區(qū)較遠(yuǎn)；活動(dòng)的基因、RNA相關(guān)蛋白、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白分布在CD區(qū)外。和這些蛋白、基因的行為一致，活動(dòng)性差的就在比較緊密的CD區(qū)內(nèi)，不對(duì)外開放；活動(dòng)性強(qiáng)的則在緊密的CD區(qū)外，便于實(shí)現(xiàn)相關(guān)功能 － 說白了就是看圖說話，數(shù)據(jù)展示用熱圖，這樣比較炫酷

再進(jìn)一步，作者還發(fā)現(xiàn)，在CD區(qū)或離CD區(qū)越近（如紫色標(biāo)記的6級(jí)），分子量越小 – CD區(qū)比較緊密，需要“瘦小的身材” – 充分發(fā)散故事，增加文章豐富性

CD和IS一個(gè)很大的區(qū)別在于緊密度，CD區(qū)很致密，作者選了一個(gè)致密的DNA需要打開的情景 – 細(xì)胞周期中需要進(jìn)行DNA復(fù)制的S期：EdU會(huì)摻入正在復(fù)制的DNA，可見S期早期EdU主要分布在CD區(qū)外，隨著S期進(jìn)展，到S期晚期，CD區(qū)內(nèi)EdU增加

致密的CD區(qū)由壓縮的染色質(zhì)折疊而成，CTCF和cohesin調(diào)節(jié)染色質(zhì)的折疊、DNA loop擠出（如左圖），作者做了一個(gè)可誘導(dǎo)敲除cohesin亞單位RAD21的細(xì)胞系，想看看敲掉調(diào)節(jié)染色質(zhì)折疊的蛋白R(shí)AD21后CD和IS的變化

可以看到，敲掉RAD21后，CD、IS分布并未受到影響，組蛋白的分布、量也沒發(fā)生變化，暗示染色質(zhì)3D結(jié)構(gòu)、表觀層面沒發(fā)生顯著變化，并不依賴cohesin

作者主要關(guān)注的是致密的染色質(zhì)組成的CD區(qū)，SIM和電鏡圖向我們展示了CD區(qū)。為了便于和電鏡圖比對(duì)，SIM圖顏色做了反轉(zhuǎn)，本該是白色有強(qiáng)熒光信號(hào)的CD區(qū)成了黑色，能看到，兩項(xiàng)技術(shù)對(duì)CD區(qū)的呈現(xiàn)類似，電鏡由于分辨率更高，讓我們看到了CD區(qū)內(nèi)的細(xì)節(jié)。基于前面的數(shù)據(jù)，能推出致密的CD區(qū)處于抑制狀態(tài)，CD區(qū)周圍活動(dòng)著各種DNA、RNA相關(guān)事件，如復(fù)制、轉(zhuǎn)錄，在DNA復(fù)制時(shí)，致密的CD區(qū)會(huì)“打開”

文章真的一點(diǎn)也不復(fù)雜，核酸染料染個(gè)細(xì)胞核，再加幾個(gè)抗體染蛋白，而后就是拍片子。電鏡用于錦上添花，不需要太多圖，關(guān)鍵在于會(huì)講故事、會(huì)呈現(xiàn)數(shù)據(jù)……

Ezequiel Miron， Roel Oldenkamp， Jill M． Brown， David M． S． Pinto， C． Shan Xu， et al． Chromatin arranges in chains of mesoscale domains with nanoscale functional topography independent of cohesin ［J］ Science advances， 23 September 2020．

參考文獻(xiàn)：

Weimin Wang， Michael Green， Jae Eun Choi， Miguel Gijón， Paul D． Kennedy， et al． CD8＋ T cells regulate tumour ferroptosis during cancer immunotherapy ［J］．Nature， 2019．