作為很多人的心頭好，酸奶稱得上是一種美味、健康兼得的飲品。它不僅保留了牛奶本身的香濃和營(yíng)養(yǎng)，而且因?yàn)榻?jīng)歷了發(fā)酵過(guò)程而擁有酸甜可口、易消化吸收的特點(diǎn)。不僅如此，酸奶中含有的益生菌已被證實(shí)有益人體消化系統(tǒng)健康，甚至可以被用于治療或緩解消化道疾病。

然而，你能想到酸奶還能為改良骨外科手術(shù)帶來(lái)啟發(fā)嗎？

最近，來(lái)自湖北大學(xué)、天津大學(xué)、西安交通大學(xué)、北京大學(xué)、香港大學(xué)和華中科技大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)從酸奶中的一種益生菌“身上”找到了靈感。

他們通過(guò)在鈦種植體表面培養(yǎng)干酪乳桿菌得到了菌膜覆蓋的改良種植體，并驗(yàn)證了改良種植體具有抵抗致病菌感染、促進(jìn)骨結(jié)合的作用，以及應(yīng)用于骨外科種植體手術(shù)的潛力。相關(guān)工作以“Engineered probiotics biofilm enhances osseointegration via immunoregulation and anti－infection”為題，于 11 月 13 日發(fā)表在《科學(xué)進(jìn)展》（Science Advances）雜志上。

（來(lái)源：Science Advances）

用菌膜改良種植體的設(shè)想

那么，問(wèn)題來(lái)了，研究人員是如何將酸奶中的益生菌與骨外科手術(shù)聯(lián)系在一起的？

骨外科手術(shù)是修復(fù)嚴(yán)重骨折、骨骼畸形的必要方法。骨外科手術(shù)中常使用金屬種植體（implant）固定損傷的骨骼，來(lái)輔助骨骼愈合或維持正常的骨骼形態(tài)。種植體在植入人體后需要能夠與骨骼形成骨結(jié)合（osseointegration），即種植體和骨骼直接接觸形成骨組織連接，而之間沒(méi)有任何其他組織間隔。因此，種植體材料通常為生物相容性好的金屬，比如鈦和鈦合金。

在骨外科種植體手術(shù)中，種植體與人體組織連接處的致病菌感染和成骨活性不足是導(dǎo)致手術(shù)失敗、康復(fù)緩慢的兩個(gè)主要因素，這些情況的發(fā)生也會(huì)增加醫(yī)療成本和患者的病痛。

為解決這兩個(gè)難題，現(xiàn)有方案通常會(huì)使用抗生素類藥物或重金屬?gòu)?fù)合抗菌材料（如銀鋅復(fù)合材料），來(lái)預(yù)防致病菌感染；使用骨肽和生長(zhǎng)因子等促成骨藥物進(jìn)行輔助。

然而，這些方案遠(yuǎn)非最優(yōu)解：抗生素類藥物有破壞人體有益菌群、導(dǎo)致多重感染、產(chǎn)生耐藥病菌的風(fēng)險(xiǎn)；重金屬具有生物毒性，與種植體生物相容性的要求相悖；而外源添加促成骨因子則需要精細(xì)設(shè)計(jì)和嚴(yán)格配比，使用起來(lái)也并不簡(jiǎn)便。

如果換一種思路，從種植體方面進(jìn)行改良又如何？

針對(duì)前文提出的問(wèn)題，理想的種植體應(yīng)該相應(yīng)地滿足兩個(gè)條件：

（1）具有較高的生物活性，能夠促進(jìn)骨骼組織的生成，使種植體和骨骼可以較快地產(chǎn)生骨結(jié)合；

（2）具有抵抗耐藥性致病菌感染的能力，能夠防止術(shù)中和術(shù)后感染。

于是，研究人員把目光轉(zhuǎn)向了在醫(yī)學(xué)研究中越來(lái)越受到重視的微生物，更具體地說(shuō)，是已經(jīng)被廣泛用于食品工業(yè)中、對(duì)人體安全且有益的一類微生物——益生菌。

眾所周知，益生菌在人體內(nèi)扮演著維持消化道健康的重要角色，具有消殺致病菌、調(diào)節(jié)宿主消化和免疫系統(tǒng)的作用。因此，益生菌被廣泛應(yīng)用于治療多種消化道疾病，比如炎癥性腸道疾病、腸易激綜合征、感染性腹瀉等。此外，益生菌還能應(yīng)用于改善炎癥性疾病和促進(jìn)組織再生。

但是，活菌進(jìn)入血液可能帶來(lái)菌血癥和敗血癥的風(fēng)險(xiǎn)，所以大部分益生菌必須口服攝入，這給臨床應(yīng)用帶來(lái)了局限性。

作為“健康三益菌”之一，干酪乳桿菌（Lactobacillus casei， L． casei）是酸奶中常見(jiàn)的益生菌，在酸奶發(fā)酵工業(yè)中被廣泛使用。它可以產(chǎn)生細(xì)菌素、乳酸、過(guò)氧化氫等抗菌物質(zhì)，且對(duì)于多種致病菌都展現(xiàn)出了優(yōu)秀的抗菌性能。同時(shí)，它的細(xì)胞壁還含有肽聚糖、脂磷壁酸等物質(zhì)，能夠調(diào)節(jié)人體免疫系統(tǒng)。但是，出于對(duì)敗血癥風(fēng)險(xiǎn)的擔(dān)憂，此前的研究還未探索過(guò)將干酪乳桿菌應(yīng)用于外科手術(shù)的可行性。

種植體植入人體后，會(huì)引起異體排斥反應(yīng)和初步炎癥反應(yīng)。在這個(gè)過(guò)程中，人體巨噬細(xì)胞（Macrophage）會(huì)聚集在種植體表面。巨噬細(xì)胞的活動(dòng)對(duì)于調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和組織再生具有重要作用，它們能夠分泌成骨因子，如抑癌蛋白M（oncostatin M， OSM）。成骨因子能誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells， MSCs）成骨分化，促進(jìn)骨組織生成、種植體和骨骼產(chǎn)生骨融合。而多糖（如脂多糖）能夠激活巨噬細(xì)胞表面的相關(guān)受體（Toll－like receptor， TLR），使巨噬細(xì)胞產(chǎn)生成骨因子。

細(xì)菌附著在物體表面，進(jìn)行繁殖、分化和分泌胞外基質(zhì)，形成有組織的膜狀聚集體，稱為“菌膜”（biofilm）。菌膜主要由細(xì)菌和其周圍的胞外聚合物（extracellular polymeric substance， EPS）基質(zhì)組成，而干酪乳桿菌的細(xì)胞壁和EPS中都含有脂多糖。

研究者們?cè)O(shè)想，在種植體表面覆蓋一層干酪乳桿菌菌膜進(jìn)行改良，植入后巨噬細(xì)胞聚集在種植體周圍，而種植體表面的菌膜中含有的多糖就可以刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生成骨因子，促進(jìn)骨融合。

圖 ｜ 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)想（來(lái)源：Science Advances）

在種植體表面覆蓋一層干酪乳桿菌菌膜，在安全無(wú)害的同時(shí)，還應(yīng)該具有抗耐藥性致病菌和促進(jìn)骨結(jié)合的功能。這正是改良種植體、解決手術(shù)難題的可能方案。

為種植體“鍍”上一層安全菌膜

研究人員用堿熱處理的鈦（AHT－Ti）種植體作為培養(yǎng)基質(zhì)，在其表面培養(yǎng)干酪乳桿菌，培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)為3天，使種植體表面覆蓋干酪乳桿菌菌膜。堿熱處理的作用是使鈦種植體表面生物活性增加，利于生物細(xì)胞的黏附和增殖，促進(jìn)菌膜的形成和種植體骨結(jié)合，即“活化”。

如何解決活細(xì)菌進(jìn)入血液導(dǎo)致敗血癥的風(fēng)險(xiǎn)呢？研究人員對(duì)覆蓋菌膜的種植體進(jìn)行了短時(shí)間紫外線輻射滅活，在殺死細(xì)菌的同時(shí)保留了菌膜中的活性物質(zhì)。對(duì)滅活后的菌膜進(jìn)行活性檢驗(yàn)染色（活菌呈綠色，死菌呈紅色），染色后的菌膜呈現(xiàn)紅色熒光（如下圖C），說(shuō)明菌膜中的細(xì)菌被成功滅活。

通過(guò)這種方式，研究人員成功得到了干酪乳桿菌菌膜覆蓋的活化鈦種植體（L． casei－AHT－Ti）。

圖 ｜ L． casei－AHT－Ti的表面（來(lái)源：Science Advances）

此外，為驗(yàn)證菌膜是否“不懼”耐藥性致病菌，研究人員選用了目前臨床手術(shù)中常見(jiàn)的廣譜耐藥性致病菌——耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌（MRSA）進(jìn)行了測(cè)試。

實(shí)驗(yàn)用未活化的鈦種植體、堿熱處理活化的鈦種植體作為活化鈦種植體的兩個(gè)對(duì)照組。在三組種植體上分別接種MRSA進(jìn)行培養(yǎng)，每2個(gè)小時(shí)測(cè)量一次菌液的光密度（optical density， OD），共培養(yǎng)12小時(shí)。用得到的數(shù)據(jù)繪制OD曲線（如下圖E）。

圖 ｜ 抗MRSA性能測(cè)試（來(lái)源：Science Advances）

OD數(shù)值越大，菌液中細(xì)菌濃度越高、數(shù)量越多，說(shuō)明MRSA增殖越活躍，種植體樣本的抗致病菌性能越差。從OD曲線圖中可以看出，在12小時(shí)的培養(yǎng)過(guò)程中，活化鈦種植體的OD曲線明顯低于鈦種植體、堿熱處理活化的鈦種植體，這說(shuō)明活化鈦種植體在抑制MRSA的能力方面表現(xiàn)更佳。在后續(xù)的涂布平板實(shí)驗(yàn)中，活化鈦種植體的MRSA菌落數(shù)量更是比其他兩者減少了三個(gè)數(shù)量級(jí)，抗MRSA的效率達(dá)到了驚人的99．98％。

但是，從圖F又可以看出，菌膜培養(yǎng)時(shí)間為1天和2天的堿熱處理鈦種植體（L． casei－AHT－Ti－1、L． casei－AHT－Ti－2）相比于菌膜培養(yǎng)時(shí)間為3天的L． casei－AHT－Ti抗菌性能明顯下降。研究人員檢測(cè)了菌膜中抗菌活性物質(zhì)乳酸（Lactic acid）和過(guò)氧化氫（H2O2）的含量，發(fā)現(xiàn)乳酸含量有明顯的減少。通過(guò)SDS－PAGE檢測(cè)抗菌活性物質(zhì)細(xì)菌素（bacteriocin）的分泌量，發(fā)現(xiàn)L． casei－AHT－Ti最高。根據(jù)這些結(jié)果推測(cè)，乳酸和細(xì)菌素可能是L． casei－AHT－Ti發(fā)揮抗菌性能的主要功能物質(zhì)。

“喚醒”巨噬細(xì)胞、“推進(jìn)”成骨分化

為驗(yàn)證L． casei－AHT－Ti是否有激活巨噬細(xì)胞（Macrophage）的性能，研究人員進(jìn)行了多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。

研究人員首先對(duì)三組種植體樣本表面的巨噬細(xì)胞進(jìn)行DAPI（呈藍(lán)色）和FITC－phalloidin（呈紅色）染色，以觀察種植體表面分布的巨噬細(xì)胞的形態(tài)和生存能力（如下圖A、B），。結(jié)果顯示，L． casei－AHT－Ti表面的巨噬細(xì)胞與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異，這說(shuō)明L． casei－AHT－Ti對(duì)巨噬細(xì)胞沒(méi)有毒性。

之后，研究人員用RT－PCR分別檢測(cè)了三組種植體樣本表面巨噬細(xì)胞的成骨因子OSM、促炎癥因子TNF－α、抑炎癥因子IL－10的表達(dá)量（如下圖C、D、E）。OSM、TNF－α、IL－10能誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞和成骨細(xì)胞的骨性分化�？梢园l(fā)現(xiàn)，L． casei－AHT－Ti表面巨噬細(xì)胞表達(dá)OSM、TNF－α、IL－10相比對(duì)照組都有明顯增多。由此可以推測(cè)，L． casei－AHT－Ti可能具有激活巨噬細(xì)胞分泌成骨過(guò)程相關(guān)細(xì)胞因子的作用。

圖 ｜ 激活巨噬細(xì)胞性能測(cè)試（來(lái)源：Science Advances）

除此之外，研究人員還發(fā)現(xiàn)L． casei－AHT－Ti表面巨噬細(xì)胞的多個(gè)成骨細(xì)胞分化相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)（如下圖B、C），其中包括能與菌膜中的多糖結(jié)合激活巨噬細(xì)胞的脂多糖受體CD14，與巨噬細(xì)胞生產(chǎn)OSM相關(guān)的COX2、PGE2、EPR，以及調(diào)控炎癥反應(yīng)的IL－1b、IL－6、TNF－α、IL－10。

據(jù)此，研究人員提出了L． casei－AHT－Ti激活巨噬細(xì)胞、促進(jìn)骨生成的完整過(guò)程（下圖D）：干酪乳桿菌菌膜與巨噬細(xì)胞接觸，菌膜中的脂多糖與巨噬細(xì)胞膜上的CD14結(jié)合，激活TLR，促使巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎癥因子IL－1b、IL－6、TNF－α和生產(chǎn)OSM相關(guān)的COX2、PGE2、EPR，促進(jìn)初步炎癥反應(yīng)和成骨因子OSM的生成，刺激成骨細(xì)胞分化。

圖 ｜ 促使巨噬細(xì)胞產(chǎn)生骨誘導(dǎo)細(xì)胞因子（來(lái)源：Science Advances）

成骨因子的分泌量增加后，能否成功誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞骨性分化？為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，研究人員用三組樣本的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)溶液分別對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行孵育，成功證明了L． casei－AHT－Ti能夠在體外實(shí)驗(yàn)條件下增加間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。

具備應(yīng)用于骨外科手術(shù)的潛力

但是，要想證明L． casei－AHT－Ti有應(yīng)用于骨外科手術(shù)的潛力，僅有體外實(shí)驗(yàn)作為支持是不夠的。于是，研究人員用大鼠進(jìn)行了每組樣本量為3的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，他們給脛骨骨折的大鼠分別手術(shù)植入了三種種植體，并添加了一組在術(shù)中在種植處添加MRSA的實(shí)驗(yàn)，以檢驗(yàn)大鼠體內(nèi)條件下不同種植體的骨結(jié)合和抗致病菌性能。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在體內(nèi)條件下，L． casei－AHT－Ti也展現(xiàn)出比兩組對(duì)照種植體更優(yōu)的性能。

在添加MRSA的術(shù)后12小時(shí)進(jìn)行的涂布平板實(shí)驗(yàn)中，L． casei－AHT－Ti相比于Ti的抗MRSA效率為98．1％，；根據(jù)無(wú)菌條件術(shù)后4周進(jìn)行的三維顯微CT計(jì)算骨體積分?jǐn)?shù)（BV／TV），以及根據(jù)VG固定染色計(jì)算骨面積比率（bone area ratio），L． casei－AHT－Ti的數(shù)值都顯著高于兩組對(duì)照種植體。這些結(jié)果證明了，L． casei－AHT－Ti在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)條件下具有抵抗致病菌感染和促進(jìn)骨生成、骨結(jié)合的性能。

以上結(jié)果表明，L． casei－AHT－Ti在體外和大鼠體內(nèi)都具有抗耐藥性致病菌MRSA和激活巨噬細(xì)胞、促進(jìn)成骨分化和骨結(jié)合的作用。用干酪乳桿菌菌膜改良鈦種植體的成功嘗試，為骨外科手術(shù)提供了一條安全性高、富有潛力的新思路。

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