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題目：乳腺癌近端和遠(yuǎn)端切除的形態(tài)正常組織中四種亞型的特征

一、研究背景

廣泛的乳腺X射線攝影篩查項(xiàng)目和改進(jìn)的自我監(jiān)測(cè)醫(yī)療體系能更早地發(fā)現(xiàn)乳腺癌，保乳手術(shù)是患病女性有成效的治療方法。目前完全切除癌變組織的判別標(biāo)準(zhǔn)是基于手術(shù)切緣的組織學(xué)檢查，然而，盡管無(wú)瘤邊緣檢查的結(jié)果清晰，高達(dá)40％的女性在術(shù)后發(fā)生局部復(fù)發(fā)，表明形態(tài)正常的乳腺可能存在導(dǎo)致癌癥復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)增加的早期改變。目前，缺乏關(guān)于癌旁組織空間位置的詳細(xì)信息數(shù)據(jù)，研究人員無(wú)法使用數(shù)據(jù)集分析任何距離相關(guān)效應(yīng)，即便現(xiàn)今存在對(duì)癌旁組織的研究，然而這些研究并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)它們的治療意義。

二、研究思路

三、結(jié)果解析
      1． 隊(duì)列特征

分別從已獲知情同意的乳腺癌患者（n ＝ 57）以及年齡匹配的風(fēng)險(xiǎn)降低（n ＝ 5）和乳房縮小成形術(shù)（n ＝ 5）患者中采集新鮮組織樣本，對(duì)其進(jìn)行宏觀評(píng)估后，收集腫瘤和腫瘤近端（TP，＜ 2 cm）、遠(yuǎn)端（TD，5－10 cm）肉眼觀察正常組織的樣本作為單個(gè)冷凍組織塊，對(duì)每個(gè)組織塊進(jìn)行腫瘤和非腫瘤組織的組織病理學(xué)表征。此外，還將浸潤(rùn)性腫瘤和非腫瘤組織中存在的任何相關(guān)良性乳腺疾病的關(guān)鍵病理學(xué)特征記錄下來(lái)，其中包含從風(fēng)險(xiǎn)降低和乳房縮小形成術(shù)標(biāo)本中采樣的特征。（參考https：／／doi．org／10．6084／m9．fifigshare．12656702中的附表數(shù)據(jù)集1）

圖1 代表性免疫組織化學(xué)圖像和樣本類型的位置

2． 匹配的癌旁組織學(xué)正常（HN）組織在其轉(zhuǎn)錄組譜中表現(xiàn)出異質(zhì)性

前5000個(gè)最可變基因的主成分分析（PCA）顯示了反映惡性腫瘤的第一個(gè)主成分。腫瘤譜和RM（乳房縮小成形術(shù)）譜聚集在轉(zhuǎn)錄空間的不同區(qū)域，RM在轉(zhuǎn)錄組譜中表現(xiàn)出最大的同質(zhì)性，而形態(tài)正常樣本（TP和TD）的表達(dá)譜表現(xiàn)出很大的異質(zhì)性。

附圖1 形態(tài)正常組織轉(zhuǎn)錄組學(xué)景觀的PCA

3．癌旁匹配的HN組織顯示腫瘤相關(guān)特征

為了探索標(biāo)本可能表現(xiàn)出的潛在腫瘤特征，將PAM50單樣本預(yù)測(cè)因子應(yīng)用于腫瘤和正常數(shù)據(jù)。正常樣的RM樣本在HN組織中觀察到腫瘤樣特征，管腔腫瘤HN譜中分配給正常樣亞型的樣本數(shù)量隨著與原發(fā)腫瘤距離的增加而增加，但三陰性腫瘤匹配譜中的TP組報(bào)告了大多數(shù)正常樣組織。

接著，評(píng)估了匹配的正常組織是否基于PAM50內(nèi)在亞型預(yù)測(cè)總生存期。TCGA癌旁樣本根據(jù)其PAM50分子亞型進(jìn)行分層，并進(jìn)行單變量Cox回歸分析，發(fā)現(xiàn)該隊(duì)列中的分子亞型與結(jié)局無(wú)顯著相關(guān)性（對(duì)數(shù)秩p ＞ 0．1）。

（參考https：／／doi．org／10．6084／m9．fifigshare．12656702中的附表數(shù)據(jù)集2）

附圖2 根據(jù)其原發(fā)腫瘤的臨床分類患者的近端和遠(yuǎn)端樣本的分子分類

4． 近端和遠(yuǎn)端組織中存在癌癥相關(guān)畸變

為識(shí)別腫瘤和相對(duì)應(yīng)組織中的異常特征，以RM為基線，對(duì)腫瘤和匹配的正常組織進(jìn)行差異表達(dá)分析。結(jié)果顯示，DE基因總數(shù)減少與距原發(fā)性腫瘤的距離有關(guān)（FDR≤0．05和LogFC≥1），在每個(gè)比較組中上調(diào)基因的趨勢(shì)大于下調(diào)基因。

使用KEGG和Reactome，定義GO terms并進(jìn)行基因集富集分析（GSEA），來(lái)闡明被破壞的基本通路。在腫瘤樣本檢查中突出顯示先前與癌癥相關(guān)的通路，TP組織中受影響的主要途徑包括細(xì)胞對(duì)外界刺激的反應(yīng)和趨化，最突出的是代謝途徑的持續(xù)失調(diào)。GSEA分析最顯著的結(jié)果是EMT（上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化）、脂肪酸代謝、雄激素反應(yīng)、癌癥相關(guān)信號(hào)通路mTORC1和凝血。TD組織中細(xì)胞對(duì)外界刺激的反應(yīng)（熱應(yīng)激反應(yīng)）、細(xì)胞外基質(zhì)組織和運(yùn)動(dòng)持續(xù)受到影響。

綜上，DE分析報(bào)告顯示，與RM組織相比，癌癥近端和遠(yuǎn)離癌癥切除的形態(tài)正常組織表現(xiàn)出分子改變。

附圖3 以RM為基線，對(duì)腫瘤和匹配的正常組織進(jìn)行差異表達(dá)分析

附圖4 每個(gè)空間群中富集的GO terms和通路

在匹配的HN組織中鑒定出四種轉(zhuǎn)錄亞型RNA－seq數(shù)據(jù)的非負(fù)矩陣分解（NMF）鑒定出代表腫瘤和“正�！北硇偷膬深悾ü采�系數(shù)1），并獨(dú)立于腫瘤特征評(píng)估匹配的正常樣本（TP、TD、RR和RM）特征。通過(guò)HN轉(zhuǎn)錄組圖譜的NMF分類，確定了樣品中穩(wěn)定的且與距原發(fā)腫瘤的距離無(wú)關(guān)的4個(gè)類，并通過(guò)識(shí)別一個(gè)含414個(gè)基因的分類器為選擇的聚類解決方案，生成聚類之間有關(guān)差異豐富的基因的豐度熱圖。這些亞型根據(jù)其分類器屬性和通路富集命名為：（i）代謝；（ii）免疫；（iii）基質(zhì)組／EMT；和（iv）nc富集。

附圖5 樣本的NMF共識(shí)聚類

圖2 在匹配的HN組織中鑒定出4種亞型

為了驗(yàn)證這些亞型并確定潛在的治療靶點(diǎn)，對(duì)腫瘤亞組（n ＝ 11）及其匹配標(biāo)本（n ＝ 22）進(jìn)行了磷酸蛋白質(zhì)組分析。隨后進(jìn)行激酶底物富集分析（KSEA），通過(guò)將磷酸化位點(diǎn)與已知的上游激酶匹配來(lái)推斷激酶活性。（參考https：／／doi．org／10．6084／m9．fifigshare．12656702中的附表數(shù)據(jù)集4＆5）

圖3 每個(gè)轉(zhuǎn)錄組中組織的磷酸蛋白質(zhì)組譜表現(xiàn)出與不同的生化和信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程相關(guān)的蛋白質(zhì)中磷酸化和激酶活性的改變

代謝亞型

相對(duì)于免疫、基質(zhì)組／EMT和nc富集亞型，代謝亞型（n ＝ 11）表現(xiàn)出其轉(zhuǎn)錄組和磷酸蛋白質(zhì)組特征的最大整體失調(diào)，尤其是代謝過(guò)程介質(zhì)、脂質(zhì)和膽固醇代謝以及缺氧相關(guān)事件，這在癌癥相關(guān)代謝和增殖事件的富集中得到了例證。此外，調(diào)節(jié)溶質(zhì)載體（SLC）和ATP結(jié)合情況成員的基因和通路（特別是缺氧誘導(dǎo)的和支持葡萄糖運(yùn)動(dòng)的基因和通路）的過(guò)度表達(dá)可以增加代謝亞型與細(xì)胞代謝相關(guān)的前提。磷酸化分析確定了潛在激酶藥物靶標(biāo)中的激酶活化位點(diǎn)，如AURKB、CDK5和GSK－3β。作者的發(fā)現(xiàn)表明，代謝回路的畸變可延伸到遠(yuǎn)端組織并不局限于原發(fā)腫瘤或其附近。

免疫亞型

免疫亞型（n ＝ 16）HN組織中富集的主要基因、terms和通路，磷酸蛋白質(zhì)組分析和激酶組底物富集表明免疫相關(guān)特征的激活與過(guò)度表達(dá)，并且存在與炎癥和免疫應(yīng)答相關(guān)的激酶底物SGK1、IKKB、p70S6K、HIPK2活化。胰島素途徑和α6整合素參與免疫監(jiān)視和免疫代謝反應(yīng)。

基質(zhì)組／EMT

該亞型（n ＝ 8）富集在基質(zhì)體和EMT元件中，與基質(zhì)體附屬蛋白、調(diào)節(jié)因子和分泌因子合作調(diào)節(jié)細(xì)胞行為，提供增殖、分化和遷移的基礎(chǔ)線索。結(jié)合一系列與基質(zhì)組功能相關(guān)的基因，分析表明KIF14、KIF18B、TUBA3D和TUBA3E以及微管組織支持機(jī)制的其他組分的mRNA水平升高，蛋白質(zhì)組學(xué)分析展示了與血管生成和轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)相關(guān)的活性富集，包括E－鈣黏蛋白、內(nèi)皮素、參與TGF－β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（SMAD依賴性和SMAD非依賴性）和Aurora A信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的通路。該組確定的潛在激酶靶向治療靶點(diǎn)包括MAP3K8、GRK2和AURKA。與癌癥進(jìn)展相關(guān)的骨橋蛋白介導(dǎo)的事件和相關(guān)通路，在基質(zhì)組和代謝亞型中都被廢棄。

非編碼（nc）富集亞型

nc富集亞型（n ＝ 12）富集了功能尚未確定的反義（n ＝ 10）、lincRNA（n ＝ 15）、假基因（n ＝ 18）和有義內(nèi)含子（n ＝ 7）基因，占nc元件的61．3％（57／93）。其中，29個(gè)元件之前在癌癥研究中已有報(bào)道，但在匹配的HN組織中沒(méi)有報(bào)道，剩下28個(gè)元件是新的。nc富集亞型的蛋白質(zhì)組譜表現(xiàn)出低水平的改變。

5．與HN組織相關(guān)的翻譯元件的功能特征概括了轉(zhuǎn)錄組亞型

通過(guò)具有樣本特異性的轉(zhuǎn)錄組學(xué)（PIT）去鑒定和推斷樣品中所有翻譯的基因組元件（TGEs），分析報(bào)告顯示，TGEs總數(shù)隨著與原發(fā)腫瘤的距離增加而減少。每個(gè)轉(zhuǎn)錄組亞型表現(xiàn)出不同和共同的翻譯特征。該亞型的明確特征與PIT庫(kù)中的選擇性剪接類別相關(guān)，富集與剪接體復(fù)合物組裝、氧化磷酸化和mRNA加工調(diào)控相關(guān)的通路和GO terms。一些調(diào)節(jié)選擇性剪接的ncRNA如NEAT1、HOTAIRM1和XIST，在nc富集的亞型中過(guò)表達(dá)，它們與剪接因子相互作用和／或影響染色質(zhì)重塑有關(guān)，這驗(yàn)證了PIT分析的發(fā)現(xiàn)。

圖4 PIT檢測(cè)數(shù)據(jù)中的翻譯模式

圖5 方框圖顯示三個(gè)眾所周知的NCRNAs與所有HN亞型和原發(fā)性乳腺癌的選擇性剪接相關(guān)的非陰性表達(dá)值

6．轉(zhuǎn)錄亞型的免疫組成表明代謝亞型中存在腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞

通過(guò)CIBERSORT來(lái)揭示每個(gè)亞型免疫特征的模式，并進(jìn)行了組間歸一化來(lái)評(píng)價(jià)每種亞型的免疫特征相互關(guān)系。代謝亞型富集了髓系細(xì)胞群，而免疫亞型富集了淋巴系細(xì)胞群，尤其是在炎癥反應(yīng)和適應(yīng)性免疫中募集的組分，如CD4 ＋ T細(xì)胞和B細(xì)胞。nc富集亞群表現(xiàn)出一種免疫組成模式，傾向于與代謝組相反，而基質(zhì)組／EMT組沒(méi)有明確的免疫特征。

圖6 轉(zhuǎn)錄亞型的去卷積分析

7． 代謝亞型表現(xiàn)出不良的預(yù)后

從TCGA BRCA數(shù)據(jù)集中選擇了108個(gè)匹配的癌旁組織來(lái)驗(yàn)證亞型。應(yīng)用基于支持向量機(jī)（svm）的建模將TCGA樣本分為四種亞型中的三種——代謝、免疫和nc富集（研究定義的基質(zhì)組／EMT亞型，在TCGA隊(duì)列中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)）。應(yīng)用單變量Cox回歸分析確定代謝標(biāo)記的預(yù)后價(jià)值（n ＝ 78），結(jié)果顯示HN組織被分配到代謝亞型的患者表現(xiàn)出不良預(yù)后（對(duì)數(shù)秩p ＜ 0．001，HR6．1）。

接著，利用414個(gè)基因標(biāo)記的單變量模型在HN組織中確定了34個(gè)具有顯著預(yù)后潛力的基因（對(duì)數(shù)秩p ＜ 0．01）。其中最具預(yù)后意義的基因是SLC2A4、LGALS12、MRC1和G0S2，它們都是定義代謝特征的基因。次要單變量模型將TCGA數(shù)據(jù)集分為兩組：年齡匹配（≤55）和年齡較大（＞ 55歲），并推測(cè)這些基因在年輕隊(duì)列中具有更大預(yù)測(cè)價(jià)值。（參考https：／／doi．org／10．6084／m9．fifigshare．12656702中的附表數(shù)據(jù)集6）

圖7 Kaplan–Meier圖顯示代謝亞型和結(jié)局之間的關(guān)系

附圖6 生存分析表明，相對(duì)于免疫和nc富集亞型，代謝組的預(yù)后更差（對(duì)數(shù)秩p ＜ 0．001，風(fēng)險(xiǎn)比6．1）

小結(jié)

這篇學(xué)習(xí)筆記從患者中采集并制作腫瘤、HN（分為TP、TD、RM、RR）標(biāo)本，通過(guò)PCA分析標(biāo)本表達(dá)譜顯示匹配的癌旁組織學(xué)正常（HN）組織在其轉(zhuǎn)錄組譜中表現(xiàn)出異質(zhì)性，后又通過(guò)對(duì)腫瘤及正常組織標(biāo)本進(jìn)行PAM50單樣本預(yù)測(cè)因子、單變量Cox回歸分析，發(fā)現(xiàn)癌旁匹配的HN組織顯示腫瘤相關(guān)特征。利用以RM為基線，差異表達(dá)分析識(shí)別、KEGG、Reactome、GO富集化分析腫瘤及匹配的正常組織標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)近端和遠(yuǎn)端組織中存在癌癥相關(guān)畸變。接著，通過(guò)NMF鑒定HN組織的轉(zhuǎn)錄亞型及分類：（i）代謝；（ii）免疫；（iii）基質(zhì)組／EMT；（iv）nc富集，后又通過(guò)磷酸蛋白質(zhì)組分析及激酶底物富集分析驗(yàn)證這些亞型及其潛在的治療靶點(diǎn)。PIT鑒定和推斷樣本中的TGEs的結(jié)果顯示與HN組織相關(guān)的翻譯元件的功能特征概括了轉(zhuǎn)錄組亞型。利用CIBERSORT、組間歸一化揭示轉(zhuǎn)錄亞型免疫特征模式及其相互關(guān)系，轉(zhuǎn)錄亞型的免疫組成表明代謝亞型中存在腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，因而，利用單變量Ｃｏｘ回歸分析用于驗(yàn)證亞型的TCGA癌旁樣本來(lái)確定代謝標(biāo)記的預(yù)后價(jià)值，發(fā)現(xiàn)代謝亞型表現(xiàn)出不良的預(yù)后。患側(cè)乳腺中腫瘤和匹配的正常組織之間相互作用的動(dòng)力學(xué)有助于解開(kāi)乳腺癌發(fā)生、進(jìn)展、復(fù)發(fā)和治療抵抗的潛在奧秘。然而，年輕乳腺癌患者可用數(shù)據(jù)缺乏，有必要進(jìn)一步研究以確定任何差異的預(yù)后和治療意義。本學(xué)習(xí)筆記的局限性還包括把握度較低，因?yàn)榭色@得原發(fā)性腫瘤、TP和TD組織標(biāo)本的隊(duì)列較�。怀闃釉O(shè)計(jì)沒(méi)有反映在公開(kāi)的數(shù)據(jù)集中，因此不可能直接復(fù)制工作流程；采樣設(shè)計(jì)和患者協(xié)變量的差異可能妨礙對(duì)結(jié)果的完全概括等等。

編輯：布丁  

校審：凍鴛鴦  糯米飯