前言

疫苗是預防傳染性疾病傳播的最有效的公共衛(wèi)生干預措施。成功的疫苗接種根除了許多威脅生命的疾病,如天花和脊髓灰質(zhì)炎,世界衛(wèi)生組織估計疫苗每年可防止200-300萬人死于破傷風、百日咳、流感和麻疹。然而,盡管常規(guī)疫苗取得了明顯的成功,但它們并不能有效對付瘧原蟲、丙型肝炎和HIV等逃避免疫監(jiān)視的病原體。此外,它們需要定期修改以應對快速變異的病原體,如流感病毒。

基于mRNA的核酸疫苗是在30多年前提出的,希望能產(chǎn)生安全、多功能、易于生產(chǎn)的疫苗。mRNA疫苗比傳統(tǒng)疫苗有許多優(yōu)點:與某些病毒疫苗不同,mRNA不會整合到基因組中,從而避免了對插入突變的擔憂;mRNA疫苗可以以無細胞的方式制造,從而實現(xiàn)快速、經(jīng)濟、高效的生產(chǎn)。此外,單個mRNA疫苗可以編碼多種抗原,增強針對適應性病原體的免疫反應,并能夠以單一配方針對多種微生物或病毒變體。

最初,由于擔心其穩(wěn)定性、低效性和過度免疫刺激,mRNA治療并沒有得到重視。然而在過去的十年中,mRNA治療領域日新月異,包括mRNA藥理學的深入研究,有效載體的開發(fā)和mRNA免疫原性的控制,使得mRNA疫苗的臨床應用進入了一個嶄新的階段。

mRNA的設計與合成

體外轉(zhuǎn)錄(IVT)mRNA模擬內(nèi)源性mRNA的結(jié)構(gòu),有五個部分,從5?到3?包括:5?cap,5?非翻譯區(qū)(UTR),一個編碼抗原的開放閱讀框,3?UTR和一個PolyA尾。

與天然真核mRNAs一樣,5′端帽結(jié)構(gòu)包含一個7-甲基鳥苷核苷,5′端結(jié)構(gòu)會在空間上保護mRNA不被核酸外切酶降解,并與翻譯起始因子蛋白協(xié)同工作,招募核糖體以啟動翻譯。PolyA尾的長度間接調(diào)節(jié)mRNA翻譯和半衰期。

編碼區(qū)兩側(cè)的5′和3′UTR調(diào)節(jié)mRNA翻譯、半衰期和亞細胞定位,來自高表達基因(如α-和β-珠蛋白基因)的天然UTR是合成mRNAs的首選。此外,UTR可根據(jù)細胞類型進行優(yōu)化,如通過去除3′UTR中的miRNA結(jié)合位點和富含AU的區(qū)域,將mRNA降解降至最低。

mRNA疫苗的開放閱讀框是最關鍵的組成部分,盡管開放閱讀框不像非編碼區(qū)那樣具有可塑性,但可以通過優(yōu)化密碼子,從而在不改變蛋白質(zhì)序列的情況下增加翻譯。例如,CureVac AG公司發(fā)現(xiàn)人類mRNA密碼子很少在第三位有A或U,從而用G或C替換開放閱讀框第三位的A或U。并將此優(yōu)化策略用于其SARS-CoV-2疫苗CVnCoV,目前正處于III期試驗階段。

為了最大化翻譯,mRNA序列通常包含修飾的核苷,例如假尿苷、N1-甲基假尿苷或其他核苷類似物。修飾核苷的使用,特別是修飾尿苷,阻止了模式識別受體的識別,保證了翻譯過程產(chǎn)生足夠水平的蛋白質(zhì)。Moderna和Pfizer–BioNTech SARS-CoV-2疫苗都含有核苷修飾。另一種避免模式識別受體檢測的策略,由CureVac首創(chuàng),使用序列工程化和密碼子優(yōu)化,通過提高疫苗mRNA的GC含量來消耗尿苷。

除了mRNA序列的改進外,在簡化mRNA生產(chǎn)方面也取得了重大進展。臨床上使用的合成mRNA通過使用噬菌體RNA聚合酶T7(也可以使用T3和SP6聚合酶)從DNA質(zhì)粒在體外轉(zhuǎn)錄。另外,使用CleanCap的共轉(zhuǎn)錄封蓋技術(shù),簡化了純化步驟。

mRNA疫苗的載體

由于mRNA較大(104–106Da)且?guī)ж撾?因此無法通過細胞膜的陰離子脂質(zhì)雙層。此外,在體內(nèi),它會被先天免疫系統(tǒng)的細胞吞噬,并被核酸酶降解。因此,體內(nèi)應用需要使用mRNA遞送載體,該載體轉(zhuǎn)染免疫細胞而不會引起毒性或不必要的免疫原性。目前,已經(jīng)為此開發(fā)了許多基于創(chuàng)新材料的解決方案。

脂質(zhì)納米顆粒(LNP)

脂質(zhì)納米顆粒是臨床上最先進的mRNA載體。截至2021年6月,所有正在研制或批準臨床使用的SARS-CoV-2 mRNA疫苗均采用LNPs。LNP為mRNA遞送提供了許多好處,包括制劑簡單、模塊化、生物相容性和較大的mRNA有效載荷容量。除RNA藥物外,LNP通常包括四種成分,可電離脂質(zhì)、膽固醇、輔助磷脂和聚乙二醇化脂質(zhì),它們共同封裝和保護脆弱的mRNA。

可電離脂質(zhì)與mRNA在酸性緩沖液中形成納米顆粒,使脂質(zhì)帶正電荷并吸引RNA。此外,它們在內(nèi)涵體的酸性環(huán)境中帶正電荷,這促進了它們與內(nèi)涵體膜的融合,將其釋放到細胞質(zhì)中。

DODAP和DODMA是第一種用于RNA輸送的可電離脂質(zhì)。通過設計提高DODMA的功效,產(chǎn)生了DLin-MC3-DMA。這是第一個FDA批準的藥物制劑中使用的可電離脂質(zhì):siRNA藥物patisiran(Onpattro)。除了有效且安全地遞送siRNA外,DLin-MC3-DMA還用于mRNA的遞送。

目前,學術(shù)界和工業(yè)界的許多團體使用組合反應方案來合成潛在的傳遞材料,這種方法產(chǎn)生了許多有效的脂質(zhì),包括C12-200、503O13、306Oi10、OF-02、TT3、5A2-SC8、SM-102(用于抗SARS-CoV-2的Moderna疫苗mRNA-1273)和ALC-0315(用于輝瑞疫苗BNT162b2)。

除了尋求提高療效外,人們越來越關注提高藥物的特異性,特別是對疫苗和免疫療法的特異性。含有多環(huán)金剛烷尾的脂質(zhì)11-A-M58,和含有環(huán)咪唑頭的脂質(zhì)93-O17S59,已被設計用于體內(nèi)靶向T細胞。盡管機制尚不清楚,但這些脂質(zhì)的環(huán)狀基團對于靶向T細胞至關重要。

盡管電離脂質(zhì)可以說是LNP最重要的成分,但其他三種脂質(zhì)成分(膽固醇、輔助脂質(zhì)和聚乙二醇化脂質(zhì))也促進了納米粒子的形成和功能。膽固醇是一種天然存在的脂質(zhì),它通過填充脂質(zhì)之間的空隙來增強納米顆粒的穩(wěn)定性,并有助于在攝取到細胞的過程中與內(nèi)涵體膜融合。

輔助脂質(zhì)通過促進有助于膜與內(nèi)涵體融合的脂質(zhì)相變來調(diào)節(jié)納米顆粒的流動性并增強功效。最佳輔助脂質(zhì)的選擇取決于可電離脂質(zhì)材料和RNA載體。例如,對于類脂質(zhì)材料,飽和輔助脂質(zhì)(如DSPC)最適合傳遞短RNA(如siRNA),而不飽和脂質(zhì)(如DOPE)最適合傳遞mRNA 。DSPC已被用于FDA批準的SARS-CoV-2疫苗mRNA-1273和BNT162b2中。

LNPs的聚乙二醇化脂質(zhì)成分由聚乙二醇(PEG)與錨定脂質(zhì)(如DMPE或DMG)結(jié)合而成。親水性PEG可以穩(wěn)定LNP,通過限制脂質(zhì)融合調(diào)節(jié)納米顆粒大小,并通過減少與巨噬細胞的非特異性相互作用增加納米顆粒半衰期。mRNA-1273和BNT162b2 SARS-CoV-2疫苗均含有聚乙二醇化脂質(zhì)。

聚合物和聚合物納米顆粒

盡管臨床進展不如LNP,但聚合物具有與脂質(zhì)相似的優(yōu)勢,能夠有效傳遞mRNA。陽離子聚合物將核酸濃縮成具有不同形狀和大小的復合物,可通過內(nèi)吞作用進入細胞。

聚乙烯亞胺是研究最廣泛的核酸傳遞聚合物。盡管其功效卓越,但由于其高電荷密度,其毒性限制了應用。此外,已經(jīng)開發(fā)出幾種毒性較小的可生物降解聚合物。例如,聚(β-氨基酯)在mRNA傳遞方面表現(xiàn)出色,尤其是對肺。

最近開發(fā)出了一種新型的含脂聚合物,稱為電荷改變可釋放轉(zhuǎn)運體(CARTs),它能有效地靶向T細胞,操縱T細胞是非常困難的,因此,CART 是一種極具吸引力的傳遞材料,在mRNA疫苗和基因治療領域具有巨大潛力。

其他遞送系統(tǒng)

除了脂質(zhì)和聚合物載體外,肽也可以將mRNA傳遞到細胞中,這要歸功于其主鏈和側(cè)鏈中的陽離子或兩親胺基(例如精氨酸),這些陽離子或兩親胺基與mRNA靜電結(jié)合并形成納米復合物。例如,含有重復的精氨酸-丙氨酸-亮氨酸-丙氨酸(RALA)基序的膜融合細胞穿透肽。

富含精氨酸的魚精蛋白肽在中性pH下帶正電荷,也可以濃縮mRNA并促進其傳遞。魚精蛋白與mRNA復合物激活識別單鏈mRNA的Toll樣受體(TLR7,TLR8)通路,因此,它還可以作為疫苗或免疫治療應用的佐劑。CureVac AG正在評估一種含有魚精蛋白的遞送平臺RNActive,用于黑色素瘤、前列腺癌和非小細胞肺癌的臨床試驗。

最后,基于角鯊烯陽離子納米乳液也可以傳遞mRNA,這些納米乳劑由油性角鯊烯核組成。一些角鯊烯制劑,如諾華的MF59,在FDA批準的流感疫苗中用作佐劑。MF59使注射部位的細胞分泌趨化因子,從而招募抗原呈遞細胞,誘導單核細胞分化為樹突狀細胞,并增強抗原呈遞細胞對抗原的攝取。角鯊烯基陽離子納米乳劑從內(nèi)涵體逃逸并將mRNA輸送到細胞質(zhì)中的機制尚不清楚。

mRNA疫苗技術(shù)創(chuàng)新

mRNA疫苗技術(shù)最重要的創(chuàng)新在于:mRNA 序列設計;開發(fā)簡單、快速和大規(guī)模生產(chǎn) mRNA 的方法;開發(fā)高效、安全的 mRNA 疫苗遞送材料。

最近的一項研究使用了一種基于細胞培養(yǎng)的系統(tǒng)選擇過程來識別新的UTRs,它顯著增加了IVT mRNA的蛋白質(zhì)表達。與人類β-珠蛋白3’UTR的相比,這些序列可以誘導相關轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生大約3倍的蛋白質(zhì)。

此外,最近報道了一種有趣的新疫苗形式,該方法利用編碼α病毒RNA依賴性RNA聚合酶的mRNA加上編碼抗原的第二個mRNA,使其在細胞質(zhì)中能夠復制。這種系統(tǒng)可以在非常低的劑量(50ng)就有效地誘導小鼠的保護性免疫反應。這些發(fā)現(xiàn)特別有吸引力,因為低劑量的使用降低了疫苗生產(chǎn)的成本。無遞送材料進一步降低了成本,簡化了制造,并且提高了疫苗凍干和在環(huán)境溫度下儲存的可能性。

在生產(chǎn)方面,除了cleancap技術(shù)外,最近開發(fā)了一種通過將雙鏈RNA污染物吸附到纖維素(一種廉價且豐富的多糖)來純化mRNA的簡單方法。研究證明,這種高度可擴展且廉價的方法與高效液相色譜法一樣有效地去除IVT mRNA樣本中的dsRNA污染物。

在遞送材料方面,與基于聚合物的CART平臺類似,mRNA-LNPs也實現(xiàn)了選擇性T細胞靶向。一種新的平臺,稱為ASSET(錨定二級靶向單鏈抗體),其中T細胞特異性單克隆抗體與LNP相連,以靶向T細胞。這種靈活的平臺在mRNA疫苗和其他應用方面也有很大的潛力。

另外一種脂質(zhì)復合物在全身給藥后優(yōu)先靶向樹突狀細胞。用mRNA疫苗選擇性靶向DC以誘導強烈的免疫反應是一個潛在的關鍵發(fā)現(xiàn),該平臺已經(jīng)在臨床試驗中證明了其前景。

mRNA疫苗在感染性疾病的研究進展

以mRNA為基礎的治療代表了一個相對新穎和高效的藥物類別。最近發(fā)表的幾項研究強調(diào)了mRNA疫苗在治療不同類型的惡性腫瘤和傳染病方面的潛在療效,這些疾病中傳統(tǒng)的疫苗策略不能引起保護性免疫反應。

截至2019年底,15種針對傳染病的候選mRNA疫苗已進入臨床試驗,當時,人們認為mRNA疫苗至少還需要5-6年才能獲得監(jiān)管部門的批準。但是,當2020年初COVID-19大流行橫行世界時,這些期望就被顛覆了。在接下來的幾個月里,mRNA疫苗的研發(fā)、制造和部署都進入了飛速跨越的階段。

SARS-CoV-2疫苗

大多數(shù)SARS-CoV-2候選疫苗對病毒表面的棘突蛋白產(chǎn)生免疫反應。棘突蛋白與其宿主細胞表面的受體血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2結(jié)合。然后,細胞的跨膜絲氨酸蛋白酶2將附著的棘突蛋白切開,該蛋白酶誘導構(gòu)象變化,暴露棘突蛋白的融合肽并促進與細胞或內(nèi)體膜的融合。通常,疫苗mRNA編碼的抗原要么是全長棘突蛋白,要么是棘突蛋白的受體結(jié)合域。

截至2021年6月18日,185個CVID-19疫苗候選處于臨床前開發(fā)階段,另外102個已進入臨床試驗。在臨床試驗中,19種為mRNA疫苗。2020年12月11日,輝瑞的BNT162b2疫苗獲得了FDA的緊急授權(quán),成為第一個獲準用于人體的mRNA藥物。一周后,Moderna疫苗mRNA-1273也被授權(quán)在美國使用。最終,它們是第一批在美國、英國、加拿大和其他幾個國家獲得授權(quán)的SARS-CoV-2疫苗。

輝瑞和BioNTech共同開發(fā)了五種mRNA候選疫苗,它們編碼棘突蛋白抗原的變體。兩個主要候選藥物BNT162b1和BNT162b2使用Acuitas Therapeutics的可電離脂質(zhì)ALC-0315和核苷修飾的mRNA,其中所有尿苷被N1甲基假尿苷取代,以增強mRNA翻譯。BNT162b1編碼三聚體分泌型棘突蛋白的受體結(jié)合域,而BNT162b2編碼全長SARS-CoV-2棘突糖蛋白,S2亞基中有兩個脯氨酸替換,將蛋白鎖定在融合前構(gòu)象。

在兩種疫苗的第一階段試驗中,都可誘導高滴度的中和抗體,并產(chǎn)生強烈的CD4+和CD8+反應,伴有輕度至中度不良反應。兩種候選疫苗耐受性良好且有效,但只有BNT162b2疫苗因其較輕的全身和局部不良反應而進入II/III期試驗。在第三階段試驗中,BNT162B2顯示了95%的整體預防和90～100%的療效。

Moderna與國立衛(wèi)生研究院合作開發(fā)了mRNA-1273。該疫苗使用了可電離脂質(zhì)SM-102制備LNP,該LNP封裝N1甲基假尿苷修飾的mRNA。該序列編碼SARS-CoV-2棘突蛋白,帶有兩個脯氨酸替換,賦予融合前構(gòu)象。

在1期臨床試驗中, mRNA-1273非常有效且耐受性良好。在涉及30420名志愿者的III期試驗中,兩支100μg劑量疫苗的預防率為94．1%,注射部位的局部疼痛是最常見的副作用。第二次給藥后,一半的志愿者報告了中度至重度系統(tǒng)性副作用(例如疲勞、肌肉疼痛、關節(jié)疼痛),這些副作用在48小時內(nèi)消失。

盡管輝瑞和Moderna公司生產(chǎn)的疫苗已證明具有良好的療效和安全性,但它們對冷鏈儲存的需求帶來了保障的巨大困難。mRNA-1273可在4-8℃下儲存持續(xù)一個月,而BNT162b2則需要在-60℃條件下儲存。

CureVac的候選疫苗CVnCoV在5℃下可穩(wěn)定儲存3個月。CVnCoV使用Acuitas Therapeutics(可能是ALC-0315)的可電離脂質(zhì)和編碼具有兩個脯氨酸替代物的全長棘突蛋白的未修飾mRNA。在第一階段臨床試驗中,志愿者產(chǎn)生的中和抗體與CVID-19恢復期患者相似,耐受性良好。然而不幸的是,在包括4萬人的III期臨床試驗中,CVnCoV僅顯示出47%的療效。中期分析表明,CVnCoV的較低療效歸因于新出現(xiàn)的SARS-CoV-2變異。

目前,CureVac正與GSK合作,開發(fā)第二代候選藥物——CV2CoV,該藥物經(jīng)過優(yōu)化,以增強相對于CVnCoV的翻譯和免疫原性。CV2CoV使用來自人類羥基類固醇17-β-脫氫酶4基因的5′UTR和來自人類蛋白酶體20S亞單位β3基因的3′UTR。在臨床前研究中,CV2CoV在體外顯示出比CVnCoV高1．8倍的蛋白表達,并在大鼠中誘導針對B．1．1．7、B．1．1．298和B．1．351變體的高滴度交叉中和抗體。

另一種耐熱候選疫苗ARCoV由中國人民解放軍軍事科學院與Walvax生物技術(shù)公司合作開發(fā),可以在25℃穩(wěn)定一周。ARCoV編碼棘突蛋白的受體結(jié)合域。在臨床前研究中,在食蟹猴中可誘導高SARS-CoV-2特異性IgG抗體和強病毒中和滴度。盡管CVnCoV和ARCoV熱穩(wěn)定性背后的原因尚不清楚,但mRNA二級結(jié)構(gòu)、較小的mRNA大小、GC含量和脂質(zhì)可能是重要因素。

其它一些mRNA候選疫苗也正在研制中。LNP-nCoVsaRNA由倫敦帝國理工學院和Acuitas Therapeutics合作開發(fā),編碼全長棘突蛋白。目前,正在使用0．1–1?g劑量遞增方案進行I期臨床試驗評估(ISRCTN17072692),其使用了所有候選mRNA疫苗中最低的RNA劑量。

另一種自擴增mRNA疫苗候選物ARCT-021(也稱為LUNAR-COV19)由Arcturus公司利用其專有的LUNAR脂質(zhì)載體和自轉(zhuǎn)錄和復制RNA(STARR)平臺開發(fā)。它編碼全長融合前棘突蛋白。

流感病毒疫苗

全世界每年約有29萬至65萬人死于流感病毒。目前的疫苗以促進病毒進入的病毒血凝素蛋白為靶標。傳統(tǒng)的流感疫苗是生長在雞蛋中的滅活流感病毒,生產(chǎn)時間長,純化困難。此外,病毒會在雞蛋中發(fā)生變異以獲得最佳生長,有時會使它們在人類中無效。

因此,確實需要替代的抗原靶點和生產(chǎn)方法。體外轉(zhuǎn)錄的合成mRNAs可以滿足這一需求,并確保在出現(xiàn)全新流感毒株時快速生產(chǎn)疫苗。例如,2013年,基于LNP(DLinDMA)的自我擴增mRNA疫苗在中國H7N9爆發(fā)后8天內(nèi)迅速研制成功,然而不幸的是,由于當時沒有用于mRNA制造的GMP設施,未能進行臨床試驗。

也有人致力于研制一種不需要每年修改的通用流感疫苗。這種疫苗可以對幾種流感病毒株和亞型產(chǎn)生免疫力。在2012年首次展示的流感mRNA疫苗,三次皮內(nèi)注射在小鼠中分別誘導針對H1N1和H5N1毒株的同源和異源免疫。

值得注意的是,不易發(fā)生突變的血凝素保守柄區(qū)最近已成為一種新型通用疫苗靶標。還有另一項研究使用LNPs來遞送50ng劑量的mRNA,編碼三種保守的流感蛋白:神經(jīng)氨酸酶、核蛋白和基質(zhì)-2離子通道蛋白以及血凝素柄區(qū)。令人難以置信的是,這種微小的mRNA劑量產(chǎn)生了廣泛的保護性抗體。

寨卡病毒疫苗

寨卡病毒感染于1947年首次被發(fā)現(xiàn),感染寨卡病毒的患者通常無癥狀或出現(xiàn)發(fā)熱、皮疹和肌肉疼痛等輕微癥狀。然而,寨卡病毒在2015-2016年美洲流行期間成為全球健康危機,該病毒在懷孕期間導致嚴重胎兒神經(jīng)畸形和胎兒死亡。膜和包膜蛋白(prM-E)是針對寨卡病毒的mRNA疫苗常見的抗原選擇,因為針對prM-E的中和抗體可以防止病毒融合。

Moderna與華盛頓大學醫(yī)學院合作,開發(fā)了一種改良的prM-E mRNA,其中包含E蛋白中的突變?nèi)诤檄h(huán)形表位。兩個10?g劑量的mRNA可保護小鼠免受寨卡病毒攻擊,并減少登革熱增強抗體的產(chǎn)生。這些令人鼓舞的臨床前結(jié)果促進了I期試驗的進行,中期結(jié)果表明,疫苗mRNA-1893在10天內(nèi)誘導94-100%的血清轉(zhuǎn)陽,耐受性良好。

此外,另一項研究使用被動免疫方法,利用基于角鯊烯的納米載體遞送編碼ZIKV中和抗體的mRNA。對于免疫系統(tǒng)受損而無法合成自身抗體的免疫缺陷患者來說,這是一種很有吸引力的方法。

HIV病毒疫苗

全球范圍內(nèi),艾滋病毒目前影響3800萬人,預計到2030年將影響多達4200萬人。盡管已進行了30年的研究,但尚未開發(fā)出有效的疫苗,這主要是因為HIV包膜蛋白具有顯著的抗原性多樣性以及隱藏關鍵包膜蛋白表位“聚糖屏障”。幾項臨床前研究已經(jīng)使用了多種載體,包括陽離子納米乳劑、DOTAP/DOPE脂質(zhì)體、Polymers和可電離LNP,它們在不同程度看到了一些效果。這些研究表明,除了有效的載體外,新的抗原對于有效地靶向HIV是非常關鍵的。

呼吸道合胞病毒疫苗

呼吸道合胞病毒是全球急性下呼吸道感染的主要原因。每年,估計有60000名5歲以下兒童死亡,超過14000名65歲以上的人死亡。

目前的RSV候選疫苗主要針對高度保守的F蛋白。盡管一些候選者由于中和抗體滴度不足而未能通過臨床試驗,但對F蛋白構(gòu)象的新發(fā)現(xiàn)表明,針對融合前構(gòu)象接種疫苗可產(chǎn)生優(yōu)異的中和抗體反應。這一發(fā)現(xiàn)有望改進未來的疫苗設計。

Moderna正在評估編碼融合前F蛋白的三種單劑量候選疫苗:mRNA-1172和mRNA-1777用于成人,以及mRNA-1345用于兒童。在I期臨床試驗中,mRNA-1777誘導RSV中和抗體產(chǎn)生強烈的體液反應,CD4+T細胞對RSV F蛋白產(chǎn)生反應,且無嚴重不良事件。mRNA-1345的序列已被進一步設計和密碼子優(yōu)化,以增強相對于mRNA-1777的翻譯和免疫原性。接種后1個月,mRNA-1345產(chǎn)生的中和抗體滴度約為mRNA-1777的八倍。最終,Moderna的目標是將mRNA-1345與其兒科人類偏肺病毒/副流感病毒3型(hMPV/PIV3)候選疫苗mRNA-1653整合,并用單一配方為兒童接種針對三種不同病原體的疫苗。

埃博拉病毒疫苗

埃博拉病毒(EBOV)于1976年首次被確定為導致埃博拉病爆發(fā)的病原體。這種病毒性出血熱在2014-2016年西非埃博拉疫情中奪走了11000多條生命。2019年,FDA批準了一種基于重組水泡性口炎病毒(VSV)的埃博拉疫苗(rVSV-EBOV)。盡管與未接種疫苗相比,rVSV-EBOV在預防埃博拉傳播方面的有效性為97．5%,但臨床試驗注意到一些安全問題(例如急性關節(jié)炎和皮疹)。

抗EBOV的mRNA疫苗可能比這種基于病毒的疫苗更安全,因為它們不會在體內(nèi)復制。一種編碼EBOV糖蛋白的mRNA疫苗已在小鼠中證明了效力。該疫苗通過CD8+和CD4+T細胞誘導糖蛋白特異性IgG抗體和IFN-γ以及IL-2的強烈表達,可保護動物免受致命病毒的傷害。

狂犬病毒疫苗

狂犬病是一種人畜共患病,以神經(jīng)癥狀為特征,死亡率近100%。盡管已有疫苗獲批,但每年仍有5萬多人死于狂犬病,這突出表明需要更有效、更廉價的疫苗。

為了滿足這一需求,CureVac利用其RNActive平臺,篩選出編碼狂犬病病毒糖蛋白的未經(jīng)修飾的mRNA疫苗CV7201。在一項臨床前研究中,CV7201可誘導小鼠和豬的高中和抗體滴度,并誘發(fā)抗原特異性CD4+和CD8+T細胞反應。但是在I期臨床試驗中發(fā)現(xiàn),雖然給藥途徑不影響免疫反應,但給藥裝置只有皮內(nèi)注射器產(chǎn)生短暫的體液免疫反應。這種弱的給藥效果以及高發(fā)生率的不良事件表明需要進一步優(yōu)化給藥平臺。

隨后,CureVac使用Acuitas Therapeutics生產(chǎn)的專有LNP作為其新疫苗CV7202的載體。在一項臨床前研究中,CV7202誘導產(chǎn)生強抗體滴度和CD8+和CD4+T細胞反應。I期臨床試驗結(jié)果表明,兩個1?g劑量可產(chǎn)生高滴度中和抗體以及強適應性免疫反應,耐受性良好。

瘧原蟲疫苗

盡管開發(fā)中的絕大多數(shù)mRNA疫苗是為了防止病毒感染,但也有預防其他傳染病的努力。瘧疾是由單細胞真核寄生蟲引起的,其發(fā)病率和殺傷力位居榜首。每年,瘧疾折磨著全世界2億多人,奪走40多萬患者的生命。由于缺乏表面抗原和瘧原蟲的復雜生命周期,抗瘧疫苗的生產(chǎn)一直很困難。幸運的是,人體對瘧原蟲感染的自然免疫反應的研究已經(jīng)確定了潛在的非表面抗原靶點。

例如,瘧原蟲分泌的細胞因子巨噬細胞遷移抑制因子(PMIF)已被證明可阻止T細胞產(chǎn)生長期記憶。根據(jù)這一發(fā)現(xiàn),從基于角鯊烯的陽離子納米乳劑中制備了一種疫苗,該納米乳劑裝載有編碼PMIF的自擴增mRNA。兩個15?g劑量可改善輔助性T細胞的發(fā)育,并誘發(fā)抗瘧原蟲IgG抗體和記憶性T細胞反應。

另一項關于瘧疾感染的機制研究發(fā)現(xiàn),惡性瘧原蟲富含谷氨酸蛋白(PfGARP)是一種潛在的mRNA疫苗靶點。一種編碼PfGARP抗原的核苷修飾mRNA疫苗正在開發(fā)中,該疫苗使用了Acuitas Therapeutics專有的LNP。臨床前研究表明,該疫苗可以降低動物感染瘧原蟲后的反應。

mRNA疫苗的關鍵問題

目前,針對mRNA疫苗的安全性人們還有很多疑惑。此外,mRNA疫苗也只有在SARS-CoV-2的預防中獲得批準,在其它方面的療效還有待進一步研究。很多問題需要解決,下面我們來一起探討未來mRNA疫苗可能會面臨的一些關鍵問題。

抗原反應持續(xù)時間

接種疫苗后,抗原被抗原呈遞細胞吸收并運輸?shù)搅馨徒Y(jié),在淋巴結(jié)中,B細胞、抗原呈遞細胞和濾泡輔助性T細胞(Tfh)之間的相互作用促進生發(fā)中心的形成。在生發(fā)中心內(nèi),B細胞隨后增殖、分化并突變其抗體基因,以產(chǎn)生針對攻擊性抗原的高親和力中和抗體。生發(fā)中心反應和Tfh細胞誘導對于持久的抗體反應至關重要,這將保護患者數(shù)月或數(shù)年。

為了增強這一免疫反應過程的第一步,一些傳遞系統(tǒng)以抗原呈遞細胞為靶點,翻譯mRNA。積極靶向抗原呈遞細胞的幾種有希望的策略包括將單克隆抗體與LNP表面結(jié)合,并用樹突狀細胞特異性配體修飾LNP表面。或者,調(diào)節(jié)LNP的物理性質(zhì),如表面電荷,已用于提高癌癥疫苗療效。

此外,通過延長抗原mRNA的翻譯來改變疫苗藥代動力學已成為增強抗體反應的令人興奮的工具。生發(fā)中心反應期間持續(xù)的抗原可用性已被證明可使抗體產(chǎn)生量增加約10倍。在小鼠中的一項研究表明,與未經(jīng)修飾的mRNA相比,核苷修飾的mRNA循環(huán)時間更長,并誘導更強的Tfh細胞和生發(fā)中心B細胞反應。

在臨床試驗中,兩次劑量的mRNA-1273也能在6個月內(nèi)引發(fā)持久的抗體反應。盡管抗體滴度在研究期間略有下降,但所有年齡組均保持較高的中和能力。這些結(jié)果是有希望的,然而,抗體反應的持續(xù)時間是一個復雜的現(xiàn)象,不同的抗原會有所不同,需要更長期的數(shù)據(jù)才能全面理解。

針對病毒的突變

病毒基因組的突變在復制過程中很常見。盡管大多數(shù)突變對病毒的功能影響很小或沒有影響,但一些突變可以增強免疫逃避,阻礙疫苗的開發(fā)。例如,30多年來,艾滋病毒的快速突變阻礙了有效疫苗的開發(fā),而流感病毒的突變需要每年對疫苗配方進行修改,以針對優(yōu)勢毒株。

新出現(xiàn)的SARS-CoV-2變異也引起了對mRNA疫苗交叉變異效力的關注。B．1．351和P．1變體在棘突蛋白受體結(jié)合域的484位(E484K)存在谷氨酸(E)到賴氨酸(K)突變,這促進了免疫逃避。幸運的是,FDA批準的mRNA疫苗BNT162b2和mRNA-1273產(chǎn)生了針對B．1．351和P．1以及其他變體的交叉中和抗體,這表明它們可以提供針對它們的保護。然而,與最先的病毒相比,交叉中和效應已經(jīng)顯著降低。此外,在CureVac的候選CVnCoV的IIb/III期試驗中,測序的124個COVID-19病例中有57%都是突變體,包括B．1．351和P．1變體。

如果這些變異毒株隨時間逐漸成為主要變異體,則可能需要變異體特異mRNA增強劑。目前,Moderna正在評估最初的mRNA-1273疫苗和作為第三劑增強劑的最新版疫苗:mRNA-1273．351,它編碼來自B．1．351變體的棘突蛋白,以及mRNA-1273．211,一種mRNA-1273和mRNA-1273．351的1:1的混合疫苗。

從長遠來看,提供SARS-CoV-2和未來冠狀病毒爆發(fā)保護的泛冠狀病毒疫苗將會更有利。與HIV和流感一樣,新的結(jié)構(gòu)洞察有望促進冠狀病毒保守位點的發(fā)現(xiàn),加速抗原發(fā)現(xiàn)和疫苗設計。

安全性

總的來說,mRNA疫苗具有良好的安全性,臨床試驗中僅發(fā)生輕度或中度不良事件。然而,也有個別事件要求進一步優(yōu)化mRNA抗原和運載工具組件。例如,CureVac基于魚精蛋白的狂犬病候選藥物CV7201在78%的參與者中引發(fā)嚴重不良事件,促使CureVac采用LNPs作為其后續(xù)狂犬病候選藥物CV7202的首選給藥平臺。

與大多數(shù)藥物一樣,mRNA疫苗的不良反應往往隨著劑量的增加而增加。例如,在CV7202的第一階段試驗中,5μg劑量具有不可接受的毒性,而1μg是耐受性良好的最高劑量。此外,在Moderna H10N8流感疫苗的第一階段試驗中,在400ug劑量患者出現(xiàn)嚴重不良事件,因此,試驗以100μg劑量繼續(xù)。

在使用Pfizer–BioNTech和Moderna的COVID-19疫苗時,分別在約百萬分之4．7和百萬分之2．5的接種者中觀察到過敏反應,這大約是傳統(tǒng)疫苗接種的2-4倍。一種說法認為,過敏反應歸因于人群中預先存在的針對LNP中聚乙二醇化脂質(zhì)的抗體。這些抗體被認為對許多消費品(例如牙膏、洗發(fā)水和瀉藥)中的PEG存在反應。據(jù)報道,40%的人群中存在抗PEG抗體,這可能會增加某些個體發(fā)生過敏反應的風險,并阻礙疫苗的效力。目前,CDC建議,對于對Pfizer–BioNTech或Moderna疫苗的任何成分有過敏史的個人,不應使用mRNA疫苗。很明顯,我們需要更好地理解mRNA疫苗配方是如何引起過敏反應的,以便可以重新設計配方以改善安全性。

特定人群的疫苗接種

大多數(shù)疫苗,無論是傳統(tǒng)疫苗還是mRNA疫苗,都是針對兒童或健康成人開發(fā)的。然而,由于免疫系統(tǒng)的不同,一些人群可能受益于替代疫苗接種策略或?qū)σ呙缃臃N的反應不同。

產(chǎn)婦/新生兒疫苗接種

懷孕期間免疫系統(tǒng)的動態(tài)特性增加了一個人對傳染病的易感性,而感染會對產(chǎn)婦健康和胎兒發(fā)育造成災難性影響。

為了應對這些挑戰(zhàn),產(chǎn)婦疫苗接種已成為改善產(chǎn)婦健康和降低新生兒發(fā)病率的工具。母體IgG抗體通過與新生兒Fc受體結(jié)合,很容易穿過胎盤,進入胎兒循環(huán),保護胎兒免受病原體的侵害。在幾項研究中,母親接種mRNA負載的LNPs可防止懷孕小鼠中的胎兒寨卡病毒傳播,并保護新生小鼠免受皰疹病毒和鏈球菌的感染。

盡管垂直轉(zhuǎn)移的母體抗體可以防止新生兒感染,但它們也會阻礙對嬰兒在以后的生活中接種疫苗的效果,其機制尚不清楚。延長抗原的可用性可能促進更強烈的生發(fā)中心反應,從而在存在母體抗體的情況下產(chǎn)生強大的嬰兒免疫反應。

抗SARS-CoV-2的mRNA疫苗也被證明對懷孕和哺乳期人群具有免疫原性,并且在臍血和人類乳汁中檢測到中和抗體。初步數(shù)據(jù)表明,mRNA-1273和BNT162b2在懷孕和非懷孕人群中引發(fā)類似的不良事件,并且疫苗不會增加新生兒死亡或先天性異常的發(fā)生率。然而,需要進一步的縱向研究來評估m(xù)RNA疫苗對產(chǎn)婦和新生兒健康的影響。

老年人

這一群體急需有效的疫苗,因為許多傳染病影響著老年人。例如,70至90%的流感相關死亡率發(fā)生在65歲以上的患者中,而COVID-19的死亡率在大于65歲的患者中是年輕患者的62倍。

老年人更難接種疫苗,因為老齡化對免疫系統(tǒng)的先天和適應性反應都有不利影響。Toll樣受體表達減少會阻止單核細胞和巨噬細胞分泌細胞因子和趨化因子,并限制與適應性免疫系統(tǒng)的串擾。由于細胞因子信號受損以及生理和細胞變化,感染期間的適應性免疫反應通常不充分。這些變化包括胸腺退化、幼稚B細胞和T細胞減少、T細胞受體多樣性減少、對T細胞凋亡的更高易感性以及細胞毒性CD8+T細胞上關鍵受體如CD28的表達減少。

幸運的是,越來越多的證據(jù)表明,mRNA疫苗可能在所有年齡組都具有強大的效力。例如,在III期試驗中,Pfizer–BioNTech的候選疫苗BNT162b2在所有治療組中的療效均超過93%。Moderna候選疫苗mRNA-1273也非常有效,在≥65歲的志愿者中顯示出86．4%的有效性,相比之下,18-65歲志愿者的療效為95．6%。

運載工具的設計對于提高老年人的疫苗效力非常重要。mRNA載體可以作為炎癥佐劑,通過增強抗原提呈細胞向注射部位的募集來放大疫苗反應。在一項臨床前研究中,CureVac的RNAVAC激活了TLR7,并在小鼠中產(chǎn)生了針對致命流感的持久免疫應答。諾華公司的乳劑MF59已經(jīng)被用作mRNA遞送載體,也可以作為佐劑。MF59增強了流感疫苗的免疫原性,已被批準用于老年人。

疫苗的獲得

獲得疫苗是實現(xiàn)廣泛預防傳染病的最大挑戰(zhàn),特別是在低收入國家。目前批準的SARS-CoV-2 mRNA疫苗的冷藏要求進一步限制了疫苗的獲取。便攜式和可重復使用的Arktek冷凍柜可以在流行病期間實現(xiàn)數(shù)百萬劑疫苗的快速部署。

然而,在COVID-19病毒需要接種數(shù)十億人,這需要耐熱疫苗。目前,有兩種SARS-CoV-2候選疫苗在室溫下具有耐熱性,如果這些耐熱候選疫苗在臨床試驗中能夠顯示出良好的結(jié)果,他們可能在不久的將來簡化全球?qū)�mRNA疫苗的獲取。

疫苗的接受度

疫苗只有在接種后才有效,支持疫苗安全性和有效性的數(shù)據(jù)非常豐富,疫苗已經(jīng)在世界部分地區(qū)根除了幾種傳染病,挽救了無數(shù)人的生命。然而,由于錯誤信息和反疫苗運動,公眾的不信任感加劇,威脅到群體免疫力的維持,并使我們最脆弱的人群處于危險之中。

疫苗接種覆蓋率下降可能導致威脅生命的疾病再次出現(xiàn)。例如,2000年從美國根除的麻疹在2019年感染了1200多人,原因是多個社區(qū)的疫苗依從性差。對于COVID-19,在美國,目前56–75%的接受度可能不足以達到至少80–90%的覆蓋率,這一閾值被認為是對SARS-CoV-2群體免疫所必需的。

盡管提高疫苗覆蓋率的大部分負擔落在政府和公共衛(wèi)生官員身上,科學界也可以通過提高mRNA疫苗的效力和安全性來提供幫助。提高療效將降低群體免疫所需的接受度,提高安全性將阻止媒體對不良事件的報道,從而減少對疫苗接種的恐懼。

小結(jié)

幾十年來,mRNA設計和核酸遞送技術(shù)的進步,加上新抗原靶點的發(fā)現(xiàn),使得mRNA疫苗成為對抗新興流行病和現(xiàn)有傳染病的非凡工具。兩種針對SARS-CoV-2的mRNA疫苗,以革命性的速度研制,并提供了卓越的保護率,有望結(jié)束COVID-19的大流行。

此外,這些疫苗將LNP和RNA治療從小眾市場的產(chǎn)品提升為在大量人群中成功實施的預防性治療。由此產(chǎn)生大量的安全性和有效性數(shù)據(jù),以及成功的監(jiān)管部門批準。我們可以樂觀地認為,mRNA療法將可能改變現(xiàn)代醫(yī)學的疫苗接種方法、癌癥免疫療法以及蛋白質(zhì)替代療法。

參考文獻:

1． mRNA vaccines for infectious diseases: principles, delivery and clinical translation． Nat RevDrug Discov． 2021 Aug 25 : 1–22．

2． Recent advances in mRNA vaccine technology． Curr Opin Immunol． 2020 Aug;65:14-20．