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前言

目前，腫瘤免疫治療方興未艾，群雄并起，其中最有效的治療策略之一就是過(guò)繼細(xì)胞轉(zhuǎn)移療法（ACT）。嵌合抗原受體（CAR）和工程化T細(xì)胞受體（TCR）是近年來(lái)主要的過(guò)繼性T細(xì)胞免疫療法。TCR工程T細(xì)胞表達(dá)腫瘤抗原特異性受體，其α鏈和β鏈由高質(zhì)量、高親和力的抗原特異性T細(xì)胞克隆產(chǎn)生。

TCR分子屬于免疫球蛋白的一個(gè)超家族，由兩個(gè)共價(jià)結(jié)合的多態(tài)性亞單位組成，每個(gè)亞單位都是抗原特異性的，它們至少與四種不同類(lèi)型的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)鏈有關(guān)。為了激活T細(xì)胞，TCR和主要組織相容性復(fù)合體（MHC）之間必須存在相互作用。

TCRs與pMHC（peptide－MHC）相互作用的強(qiáng)弱決定了未成熟胸腺細(xì)胞的命運(yùn)，對(duì)幼稚T細(xì)胞的存活至關(guān)重要。因此，TCR－T免疫治療技術(shù)通過(guò)與MHC特別是Ⅱ類(lèi)分子的有效相互作用激活宿主的免疫系統(tǒng)，后者被TCR－T細(xì)胞和CAR－T細(xì)胞特異識(shí)別。TCR－T細(xì)胞可以識(shí)別細(xì)胞內(nèi)的腫瘤特異性抗原，而CAR－T細(xì)胞主要識(shí)別腫瘤表面的特異性抗原。這使得TCR－T細(xì)胞在腫瘤治療中更有效。

目前，一些新的技術(shù)和工具正在應(yīng)用于TCR－T，有助于提高TCR－T治療的療效和安全性，TCR－T細(xì)胞治療正展現(xiàn)出抗腫瘤治療的巨大潛力。

CAR－T與TCR－T的比較

在ACT療法中、TCR－T和CAR－T細(xì)胞都已被成功地用于實(shí)體瘤的臨床治療。

CAR包含腫瘤抗原靶向的單鏈抗體、跨膜結(jié)構(gòu)域和CD3ζ的胞內(nèi)激活結(jié)構(gòu)域。通過(guò)這種方式，工程化的CAR能夠識(shí)別特定的腫瘤相關(guān)抗原，CAR能夠在不經(jīng)過(guò)MHC處理的情況下結(jié)合未經(jīng)處理的腫瘤表面抗原。

第一代CAR－T細(xì)胞表現(xiàn)出有限的擴(kuò)增和相對(duì)較短的持久性， “第二代”CAR－T加入了共刺激受體CD28、4－1BB／CD137和OX40。將這些共刺激受體添加到CAR－T細(xì)胞的CD3ζ結(jié)構(gòu)域中，從而促進(jìn)更強(qiáng)大和持久的T細(xì)胞反應(yīng)。第三代CARs同時(shí)結(jié)合兩個(gè)共刺激信號(hào)（CD28和4－1BB），這比第二代CARs具有更好的擴(kuò)增和更長(zhǎng)的持續(xù)性。

相反，TCR是與MHC抗原復(fù)合物結(jié)合的α／β異二聚體。與TCR相比，CARs識(shí)別腫瘤抗原具有某些缺點(diǎn)，如腫瘤外毒性。與CARs相比，TCRs在基于T細(xì)胞的治療中具有一些結(jié)構(gòu)性?xún)?yōu)勢(shì)，例如其受體結(jié)構(gòu)中有更多的亞單位（10：1），免疫受體基于酪氨酸的激活基序（ITAMs）更多（10：3），對(duì)抗原的依賴(lài)性更�。�1：100），以及更多的共刺激受體（CD3，CD4，CD28等等）。具有低MHC親和力范圍（104－106M－1）的TCR就可以有效的激活T細(xì)胞，相反，CARs需要更高的親和力范圍（106－109M－1）。

因此，CAR介導(dǎo)的細(xì)胞毒性依賴(lài)于更高密度的細(xì)胞表面抗原。此外，T細(xì)胞／抗原相互作用在免疫突觸（IS）結(jié)構(gòu)中啟動(dòng)，其中TCR呈現(xiàn)具有外周LFA－1粘附的環(huán)狀區(qū)域，而CAR呈現(xiàn)無(wú)環(huán)狀區(qū)域的彌散LFA－1分布。因此，TCR－IS比CAR－IS發(fā)出的信令速度慢但持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。同時(shí)，CAR－T細(xì)胞呈現(xiàn)出更快的殺傷功能，并向下一個(gè)腫瘤靶點(diǎn)遷移（連環(huán)殺傷），這與TCR－T細(xì)胞延長(zhǎng)信號(hào)傳導(dǎo)和延長(zhǎng)殺傷時(shí)間形成鮮明對(duì)比。

重組TCRs

TCR是人體最復(fù)雜的受體之一，它包含六種不同的受體亞單位，它們?cè)赥細(xì)胞中具有非常廣泛的功能。腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TILs）的TCR的改變顯著影響腫瘤特異性T細(xì)胞。其中TCR的變化有助于T細(xì)胞的增殖，TCR多樣性與抗腫瘤作用相關(guān)。

對(duì)TIL的TCR工程化是腫瘤的最佳治療方法之一。TCR由結(jié)合到肽－MHC配體的α鏈和β鏈、CD3復(fù)合體的信號(hào)亞單位（?、γ和δ）以及CD3ζ同源二聚體組成。除CD3ζ外，所有亞單位均具有細(xì)胞外免疫球蛋白（Ig）結(jié)構(gòu)域。基于這些結(jié)構(gòu)，利用工程化TCR的新技術(shù)有ImmTAC、TRuCs和TAC等。

免疫動(dòng)員單克隆T細(xì)胞受體（ImmTAC）

ImmTACs是使用工程化、可溶性和親和增強(qiáng)的單克隆TCRs（mTCRs）設(shè)計(jì)的。ImmTACs基本上是融合蛋白，結(jié)合了工程化的TCR靶向系統(tǒng)和單鏈抗體片段（scFv）效應(yīng)器功能。在ImmTACs的構(gòu)建中， TCR能夠識(shí)別來(lái)自人類(lèi)白細(xì)胞抗原（HLA）呈遞的細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)的肽。

ImmTAC通過(guò)特異性靶向腫瘤細(xì)胞表面的HLA－肽復(fù)合物，并通過(guò)scFv抗體片段與CD3的相互作用促進(jìn)T細(xì)胞介導(dǎo)的效應(yīng)器功能。ImmTAC還以劑量依賴(lài)性方式激活CD8＋T細(xì)胞，并能有效地重定向和激活效應(yīng)和記憶CD8＋和CD4＋細(xì)胞。ImmTAC通過(guò)分泌多種細(xì)胞因子表現(xiàn)出多功能反應(yīng)，如TNF－α、IFN－γ、IL－6、MIP1α－β和IFN－γ誘導(dǎo)蛋白10。

此外，選擇合適的靶抗原是ImmTACs的關(guān)鍵，質(zhì)譜技術(shù)和MHC多聚體技術(shù)有助于識(shí)別合適的抗原。值得注意的是，TCR工程化T細(xì)胞也表現(xiàn)出非預(yù)期靶向毒性�？偟膩�(lái)說(shuō)，ImmTACs已被證明能增強(qiáng)TCR－T細(xì)胞的抗腫瘤反應(yīng)，但其安全性有待進(jìn)一步研究。

T細(xì)胞受體融合結(jié)構(gòu)

T細(xì)胞受體融合結(jié)構(gòu)（TRuCs），一種與T細(xì)胞受體亞單位融合的抗體結(jié)合域，設(shè)計(jì)用于有效識(shí)別腫瘤表面抗原。TRuCs由靶向腫瘤相關(guān)抗原的特異性抗體融合到5個(gè)TCR亞基（TCRα、TCRβ、CD3?、CD3γ和CD3δ）的胞外N－末端組成，為工程化T細(xì)胞提供了新的靶向特異性和HLA非依賴(lài)性靶細(xì)胞清除能力，可被相應(yīng)的靶細(xì)胞激活。

與第二代CAR－T細(xì)胞相比，該方法顯示出更好的抗腫瘤效果。此外，TRuCs支配TCR復(fù)合體的全部信號(hào)機(jī)制，而CARs僅利用分離的CD3ζ胞內(nèi)段的有限信號(hào)。

T細(xì)胞抗原偶聯(lián)劑（TAC）

T細(xì)胞抗原偶聯(lián)劑是另一個(gè)工程化TCR細(xì)胞，以非MHC依賴(lài)性方式誘導(dǎo)更有效的抗腫瘤反應(yīng)并降低毒性。TAC嵌合蛋白通過(guò)與CD3結(jié)構(gòu)域的結(jié)合，從而形成TCR／CD3復(fù)合物并獲得更多的T細(xì)胞應(yīng)答。

TAC受體的活性與CD3結(jié)合域的選擇密切相關(guān)。例如，與UCHT1相比，來(lái)自O(shè)KT3（muromonab－CD3）的單鏈抗體具有較低的細(xì)胞因子產(chǎn)生和細(xì)胞毒性，這可能導(dǎo)致實(shí)質(zhì)上不同的功能結(jié)果。與第二代CARs相比，TAC基因工程化的T細(xì)胞不僅有利于過(guò)繼后在實(shí)體瘤的更大浸潤(rùn)，而且減少了T細(xì)胞在表達(dá)抗原的健康組織中的擴(kuò)增和腫瘤外毒性。

TCR－T細(xì)胞療法的工作流程

為了分離治療性TCR，必須首先從患者或健康獻(xiàn)血者的血液中分離抗原特異性T細(xì)胞，并在體外用特異性肽抗原以及細(xì)胞因子（如IL－2和IL－15）進(jìn)行擴(kuò)增。這一過(guò)程需要事先確定可安全靶向于患者的特定腫瘤相關(guān)肽靶點(diǎn)。在選擇了靶抗原后，可以使用不同的方法來(lái)篩選具有所需的高親和力和腫瘤特異性的TCR。臨床前安全性測(cè)試對(duì)于確保分離的高親和力TCR的最小靶外效應(yīng)和交叉反應(yīng)性也是必要的。病毒載體通常用于對(duì)自體患者T細(xì)胞進(jìn)行基因修飾，以表達(dá)經(jīng)驗(yàn)證的治療性TCR，然后再輸回患者體內(nèi)。

確定靶抗原

T細(xì)胞識(shí)別的黑色素瘤抗原1（MART－1）是TCR－T臨床試驗(yàn)中第一個(gè)靶向的腫瘤相關(guān)抗原。在這一突破之后，針對(duì)多種腫瘤抗原的TCR－T療法已經(jīng)開(kāi)發(fā)出來(lái)，包括針對(duì)MAGE－A3、MAGE－A4、GD2、間皮素、gp100、MART1、AFP、CEA、NY－ESO－1以及源自HPV和EBV的病毒肽的TCR－T療法。其中，NY－ESO－1已被證明是TCR－T細(xì)胞最有希望的靶點(diǎn)之一，在治療滑膜肉瘤方面取得了成功，客觀有效率為67％。

理想的TCR－T靶抗原顯示以下特征：（1）誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的能力；（2）與驅(qū)動(dòng)腫瘤表型（如癌基因）相關(guān)，以降低抗原丟失和腫瘤免疫逃避的風(fēng)險(xiǎn)；以及（3）在腫瘤干細(xì)胞上的表達(dá)以促進(jìn)永久性腫瘤根除。

腫瘤相關(guān)抗原的鑒定方法

高分辨率質(zhì)譜（MS）已被證明是促進(jìn)從腫瘤細(xì)胞直接識(shí)別HLA－I結(jié)合肽的最強(qiáng)大的高通量方法。在這種方法中，通過(guò)免疫沉淀（IP）從腫瘤組織或細(xì)胞系中分離HLA－I／肽復(fù)合物，然后充分洗滌并應(yīng)用酸性洗脫緩沖液，從HLA－I分子和用于IP的抗體中分離結(jié)合肽抗原。該策略允許每個(gè)腫瘤樣本識(shí)別數(shù)千個(gè)經(jīng)驗(yàn)證的肽靶點(diǎn)，并已用于識(shí)別膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GB）、黑色素瘤、腎細(xì)胞癌（RCC）和結(jié)直腸癌（CRC）等的HLA－I配體。

腫瘤新抗原的鑒定方法

盡管基于MS的技術(shù)可用于識(shí)別新抗原，但由于其相對(duì)較低的豐度以及MS的有限靈敏度，尤其是對(duì)于大小有限的腫瘤樣本，它們更難識(shí)別。然而，新一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展有助于識(shí)別和定位這類(lèi)腫瘤靶點(diǎn)。全外顯子組DNA測(cè)序，結(jié)合計(jì)算預(yù)測(cè)算法，允許識(shí)別癌細(xì)胞中的特定遺傳改變，這些改變可以產(chǎn)生突變肽，并能夠呈現(xiàn)在腫瘤HLA－I分子上。

所有體細(xì)胞突變基因都可以進(jìn)行電腦分析，以預(yù)測(cè)可能與患者個(gè)體HLA－I分子結(jié)合的潛在高親和力表位，從而被T細(xì)胞識(shí)別。隨著大型MS洗脫肽數(shù)據(jù)庫(kù)的使用，HLA－I肽結(jié)合預(yù)測(cè)算法不斷更新和改進(jìn)，其他預(yù)測(cè)算法試圖考慮與細(xì)胞內(nèi)過(guò)程復(fù)雜性相關(guān)的生物變量。

另一個(gè)經(jīng)常使用的方法是腫瘤RNA測(cè)序，它允許選擇具有最高轉(zhuǎn)錄表達(dá)的新抗原。值得注意的是，盡管這些預(yù)測(cè)方法在識(shí)別呈遞的和高免疫原性新抗原時(shí)通常表現(xiàn)出非常好的準(zhǔn)確性，但它們通常預(yù)測(cè)的新抗原靶點(diǎn)的數(shù)量比真實(shí)靶點(diǎn)的實(shí)際數(shù)量高1到2個(gè)數(shù)量級(jí)。

通過(guò)trogocytosis發(fā)現(xiàn)新抗原是近年來(lái)出現(xiàn)的一種新方法。Trogocytosis是細(xì)胞結(jié)合過(guò)程中發(fā)生的一種生物學(xué)現(xiàn)象，在此過(guò)程中，細(xì)胞共享并轉(zhuǎn)移膜和膜相關(guān)蛋白。Li等人發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞膜蛋白特異性轉(zhuǎn)移到腫瘤靶細(xì)胞，這些靶細(xì)胞呈遞同源HLA－I／肽復(fù)合物。利用這些T細(xì)胞－靶細(xì)胞相互作用，他們通過(guò)將表達(dá)標(biāo)記孤兒TCR的T細(xì)胞與同源靶細(xì)胞共同孵育，創(chuàng)建了新抗原發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)。通過(guò)將熒光標(biāo)記從T細(xì)胞轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞，該方法能夠分離這些靶細(xì)胞并對(duì)同源TCR配體進(jìn)行測(cè)序，從而建立新抗原文庫(kù)。

分離腫瘤特異性T細(xì)胞和TCR

使用HLA－I多聚體、單細(xì)胞TCR測(cè)序或抗原陰性的人源化小鼠，腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞和TCR可從自體、異體或異種細(xì)胞庫(kù)中識(shí)別鑒定。

利用HLA－I多聚體法，可通過(guò)多聚體染色和流式細(xì)胞術(shù)分選直接分離抗原特異性CD8＋T細(xì)胞。在分離成對(duì)的全長(zhǎng)TCR序列之前，對(duì)這些多克隆T細(xì)胞進(jìn)行同源肽識(shí)別和抗腫瘤功能測(cè)試。采用高靈敏度的基于PCR的單細(xì)胞TCR分析方法（TCR－SCAN），可以得到具有高親和力和特異性的TCR。

另外一種方法利用了人源化小鼠TCR基因庫(kù)，該基因庫(kù)不會(huì)發(fā)生在人類(lèi)中產(chǎn)生的T細(xì)胞克隆缺失或耐受。為此，Li等人利用整個(gè)人類(lèi)TCRα／β基因位點(diǎn)和嵌合HLA－A2轉(zhuǎn)基因構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因小鼠，以實(shí)現(xiàn)針對(duì)人類(lèi)TAA的人類(lèi)TCR的分離。

單細(xì)胞測(cè)序方法代表了高通量分離腫瘤特異性TCR編碼基因的更有前景的方法。使用靶向TCRα和TCRβ基因座內(nèi)每個(gè)單獨(dú)V和J元件的RNA誘餌文庫(kù)，可以從剪切的基因組DNA（gDNA）片段中選擇性分離TCR編碼基因組元件，用于隨后的配對(duì)末端深度測(cè)序。這使得從人類(lèi)材料或TCR人源化小鼠的寡克隆T細(xì)胞群中鑒定抗原特異性TCR成為可能。

幼稚T細(xì)胞也可以作為T(mén)CR－T治療的TCR來(lái)源。TAA和新抗原特異性T細(xì)胞可從癌癥患者外周血中的低頻前體中衍生和擴(kuò)增，并可重新輸注或用作抗原特異性TCR的來(lái)源。由于癌癥患者通常表現(xiàn)出免疫抑制或顯性T細(xì)胞耐受，HLA－I匹配的健康供體的原始序列也代表了一個(gè)可靠的來(lái)源，因?yàn)樗�具有巨大的多樣性TCR序列，理論上T細(xì)胞具有任何抗原特異性，包括腫瘤新抗原。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了高通量技術(shù)平臺(tái)，用于尋找原始的序列，以便快速有效地識(shí)別用于個(gè)性化過(guò)繼性T細(xì)胞治療的罕見(jiàn)但有治療價(jià)值的TCR。

TCR的克隆

大多數(shù)基于TCR的基因治療方法依賴(lài)于用病毒載體對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行體外轉(zhuǎn)導(dǎo)，最早用于基因治療的載體是腺病毒。然而，由于它們不能將轉(zhuǎn)基因整合到宿主基因組中，TCR表達(dá)在T細(xì)胞增殖過(guò)程中會(huì)丟失。此外，腺病毒的免疫遺傳特性也限制了其作為基因治療載體的應(yīng)用。相比之下，逆轉(zhuǎn)錄病毒作為基因轉(zhuǎn)移載體表現(xiàn)出更大的前景，因?yàn)樗鼈兛梢愿腥径喾N細(xì)胞，并有能力將轉(zhuǎn)基因插入宿主基因組，從而使異位TCRα／β鏈穩(wěn)定表達(dá)。

由γ－逆轉(zhuǎn)錄病毒如小鼠白血病病毒（MLV）衍生的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體已被廣泛用于基因轉(zhuǎn)移到人類(lèi)T細(xì)胞中。這種方法已被用于傳遞各種基因，包括自殺基因、TCR和CARs。主要缺點(diǎn)是它們不能轉(zhuǎn)導(dǎo)非增殖性靶細(xì)胞，這就排除了靜止的T細(xì)胞在TCR－T治療中的應(yīng)用。此外，逆轉(zhuǎn)錄病毒插入突變可能引起潛在的副作用。

最近，慢病毒載體（LV）作為基因轉(zhuǎn)移載體獲得了更多的關(guān)注，因?yàn)樗鼈兛梢詫⒒�因傳遞到分裂和非分裂細(xì)胞中。各種技術(shù)，如Golden Gate克隆和LR克隆，通常用于構(gòu)建插入TCRα／β基因的載體。

腺相關(guān)病毒（AAV）是另一種廣泛使用的病毒載體。與腺病毒載體相比，AAV具有較低的免疫原性和更廣泛的細(xì)胞向性，因此在腫瘤基因治療中得到了廣泛的應(yīng)用。為了促進(jìn)轉(zhuǎn)基因整合，人們開(kāi)發(fā)了自互補(bǔ)AAV載體（scAAV），使AAV獨(dú)立于宿主細(xì)胞的互補(bǔ)鏈合成，scAAV在臨床前模型中的療效優(yōu)于傳統(tǒng)AAV。

同時(shí)，一些非病毒基因編輯方法也被開(kāi)發(fā)出來(lái)。mRNA電穿孔已被證明可實(shí)現(xiàn)短暫的TCR和CAR表達(dá)，從而將病毒成分持續(xù)存在的風(fēng)險(xiǎn)降至最低。臨床數(shù)據(jù)表明，mRNA修飾的TCR－T和CAR T細(xì)胞都是可行和安全的，沒(méi)有明顯的證據(jù)表明對(duì)正常組織有非靶向毒性。然而，缺乏持續(xù)的TCR表達(dá)可能會(huì)限制療效，需要反復(fù)輸注。此外，非病毒性睡美人反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)也被用于TCR和CARs的轉(zhuǎn)導(dǎo)。

基因編輯通過(guò)同源定向修復(fù)（HDR）可以將大基因片段特異、高效地插入靶細(xì)胞。使用CRISPR／CAS9開(kāi)發(fā)的TCR－T細(xì)胞已被證明在體外特異性識(shí)別腫瘤抗原，并在體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生性抗腫瘤反應(yīng)。

TCR的驗(yàn)證方法

在TCR克隆后，需要進(jìn)行廣泛的臨床前驗(yàn)證，以證明工程化TCR－T細(xì)胞的特異性和安全性。驗(yàn)證包括通過(guò)滴定同源肽抗原來(lái)評(píng)估TCR的親和力，以及測(cè)量一組對(duì)HLA－I匹配的腫瘤細(xì)胞系的殺傷作用。如果沒(méi)有這樣的腫瘤細(xì)胞系存在，靶細(xì)胞可以轉(zhuǎn)導(dǎo)表達(dá)相關(guān)抗原和相關(guān)的HLA－I分子。新抗原也可以在自體抗原呈遞細(xì)胞中表達(dá)，以評(píng)估TCR的抗原反應(yīng)性。

安全性測(cè)試包括測(cè)試候選TCR－T對(duì)HLA－I匹配原發(fā)組織的識(shí)別能力，以確保沒(méi)有正常組織作為靶點(diǎn)，產(chǎn)生可能導(dǎo)致的非靶向毒性。在至少兩次TCR－T細(xì)胞治療臨床試驗(yàn)中，發(fā)生過(guò)對(duì)正常腦細(xì)胞和心臟細(xì)胞的交叉反應(yīng)，從而導(dǎo)致患者死亡。這些試驗(yàn)結(jié)果強(qiáng)調(diào)了TCR進(jìn)入臨床試驗(yàn)前進(jìn)行廣泛安全性試驗(yàn)的重要性。

TCR－T的安全性

TCR－T細(xì)胞的ACT顯示出很高的腫瘤殺傷，但在一些臨床研究中也出現(xiàn)了一些嚴(yán)重的不良事件。優(yōu)化工程化T細(xì)胞中的TCR親和力至關(guān)重要，受體親和力能夠決定T細(xì)胞治療的安全性和有效性。就療效而言，親和力TCR相互作用足以激活T細(xì)胞，但需要強(qiáng)親和力來(lái)維持T細(xì)胞的擴(kuò)增。

在I／II期ACT臨床試驗(yàn)中，低親和力工程化T細(xì)胞顯示出更安全的特性，但它們的抗腫瘤反應(yīng)較弱。通過(guò)識(shí)別T細(xì)胞的TCR－pMHC相互作用，可以將工程化T細(xì)胞分為高親和力型和低親和力型。此外，人們也開(kāi)發(fā)了一些技術(shù)來(lái)提高TCR－T的安全性。

基于工程化T細(xì)胞的安全開(kāi)關(guān)機(jī)制是一種有吸引力的策略。來(lái)源于單純皰疹病毒Ⅰ型（HSV－TK）的胸苷激酶基因是最常見(jiàn)的自殺基因之一。

盡管HSV－TK在基于細(xì)胞的免疫治療中顯示出安全性，但需要導(dǎo)入磷酸化的核苷類(lèi)似物。另一個(gè)更安全的誘導(dǎo)T細(xì)胞安全開(kāi)關(guān)稱(chēng)為誘導(dǎo)型caspase－9（iC9）。iC9是一種修飾的人FK結(jié)合蛋白，可通過(guò)小分子化合物AP1903激活，這一過(guò)程依賴(lài)于線粒體凋亡途徑。

iC9自殺基因的免疫原性較低，引發(fā)針對(duì)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的免疫反應(yīng)降低。基于iC9的安全開(kāi)關(guān)已經(jīng)被證明比先前的自殺基因更有潛力用于細(xì)胞治療。

TCR－T細(xì)胞治療的臨床現(xiàn)狀

截止2021年8月9日，在ClinicalTrials上共有175項(xiàng)使用TCR－T療法的研究正在進(jìn)行中，其中71項(xiàng)是針對(duì)特定TAA或新抗原的特異性TCR，有32項(xiàng)研究已經(jīng)完成。NY－ESO－1是最常見(jiàn)的靶向抗原，在多種癌癥中均有表達(dá)，包括骨髓瘤、黑色素瘤等。其他腫瘤睪丸相關(guān)抗原，如PRAME和MAGE蛋白，以及黑色素瘤分化抗原MART－1和gp100，以及最近的癌癥驅(qū)動(dòng)因子，如WT1、KRAS和TP53，也是流行的TCR－T靶點(diǎn)。                    

共有83名贊助者／合作者發(fā)起或參與TCR－T細(xì)胞治療的研究，包括美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院（NIH）、政府組織、行業(yè)和大學(xué)／學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)。目前，美國(guó)國(guó)家癌癥研究所（NCI）共支持了53個(gè)TCR－T項(xiàng)目，占到了所有正在進(jìn)行項(xiàng)目的20％。

在開(kāi)發(fā)TCR－T療法的29家制藥公司中，葛蘭素史克和Adaptimunime發(fā)起了最多的臨床試驗(yàn)，分別為11項(xiàng)和7項(xiàng)。最近，報(bào)道了一項(xiàng)針對(duì)人乳頭瘤病毒（HPV）－16 E7蛋白的TCR－T細(xì)胞治療轉(zhuǎn)移性人乳頭瘤病毒相關(guān)上皮癌的1期臨床試驗(yàn)（NCT02858310）。在這項(xiàng)研究中，12名接受治療的患者中有6名出現(xiàn)了客觀的臨床反應(yīng)，觀察到了穩(wěn)健的腫瘤消退。這是TCR－T細(xì)胞療法的一個(gè)里程碑式的臨床試驗(yàn)，證明靶向病毒抗原對(duì)病毒相關(guān)癌癥患者具有良好的臨床效果。其他被探索為T(mén)CR靶點(diǎn)的病毒抗原包括HPV－E6蛋白、來(lái)自EB病毒（EBV）的抗原和人類(lèi)內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（HERV）靶點(diǎn)，如HERV－E。

靶向TAAs 的MART－1和NY－ESO－1 TCR－T療法在晚期黑色素瘤、骨髓瘤和非小細(xì)胞肺癌中也顯示出臨床療效。完成的TCR－T臨床試驗(yàn)的總有效率（ORR）在0～60％之間。值得注意的是，這些TCR－T臨床試驗(yàn)中的大多數(shù)都只入組了少量患者（2至25名），因此ORR在統(tǒng)計(jì)上可能不太準(zhǔn)確。因此，需要更大規(guī)模的II期和III期臨床試驗(yàn)來(lái)確認(rèn)這些TCR－T療法的實(shí)際臨床療效。

TCR－T細(xì)胞治療的挑戰(zhàn)和潛在解決方案

盡管基于TCR－T細(xì)胞的免疫療法已在大部分接受治療的患者中顯示出一定的臨床療效，但在許多領(lǐng)域仍然面臨著諸多挑戰(zhàn)。這些挑戰(zhàn)包括：（1）靶向正常組織引起的免疫毒性；（2）工程化T細(xì)胞中TCR表達(dá)不足或短暫表達(dá)；（3）T細(xì)胞耗竭和功能障礙；（4）腫瘤免疫逃逸，以及（5）大多數(shù)癌癥患者缺乏有效的腫瘤特異性抗原作為靶點(diǎn)。克服這些挑戰(zhàn)將是未來(lái)取得更大臨床成功的關(guān)鍵。            

新靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)

目前，用于TCR－T的有效和安全免疫治療的肽抗原靶點(diǎn)非常有限。目前使用的大多數(shù)靶點(diǎn)是TAA，盡管在腫瘤組織中上調(diào)，但在正常組織中仍保持低水平的表達(dá)，這可能導(dǎo)致自身免疫毒性。因此，新抗原似乎是TCR－T癌癥治療最安全的靶點(diǎn)。然而，在TCR－T臨床開(kāi)發(fā)新抗原的主要挑戰(zhàn)包括：（1）新抗原形成突變?cè)诤艽蟪潭壬鲜莻�(gè)體化的，并且在癌癥患者之間存在差異，因此難以開(kāi)發(fā)出廣泛應(yīng)用的免疫治療產(chǎn)品；（2）新抗原在腫瘤組織中的表達(dá)常常是異質(zhì)性的。

盡管如此，近年來(lái)的報(bào)告強(qiáng)調(diào)了腫瘤細(xì)胞廣泛共享的免疫原性新抗原的出現(xiàn)，包括突變的KRAS和TP53。許多其他研究也證明了可用于產(chǎn)生潛在治療性腫瘤特異性TCR的共享新抗原的免疫原性。隨著下一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，特別是單細(xì)胞DNA測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和成熟的體外驗(yàn)證方法，以個(gè)性化新抗原為靶點(diǎn)的TCR－T免疫治療可能在未來(lái)幾年成為一種流行的癌癥治療方法。此外，新出現(xiàn)的TAA類(lèi)別，如癌胚抗原，也可能構(gòu)成未來(lái)TCR－T發(fā)展的可行靶標(biāo)。

最大化治療性TCR表達(dá)

轉(zhuǎn)基因α和β鏈的正確配對(duì)是阻礙TCR－T細(xì)胞發(fā)展的主要挑戰(zhàn)之一。由于每個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞包括兩條內(nèi)源性TCR鏈和兩條轉(zhuǎn)化的TCR鏈，因此具有未知特異性的異二聚體可導(dǎo)致潛在的自身免疫后果。另一個(gè)相關(guān)問(wèn)題是，不恰當(dāng)?shù)摩粒�β鏈TCR配對(duì)將競(jìng)爭(zhēng)CD3復(fù)合物，從而降低治療性TCR的表面表達(dá)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

有幾種方法可對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)的TCR鏈進(jìn)行適當(dāng)配對(duì)，包括：（1）部分鼠源化TCR的恒定區(qū)；（2）添加半胱氨酸殘基以促進(jìn)引入TCR鏈的二硫鍵；（3）改變內(nèi)源性TCR恒定區(qū)的二級(jí)結(jié)構(gòu)；（4）向轉(zhuǎn)導(dǎo)TCR的細(xì)胞內(nèi)部分添加信號(hào)域；（5）將TCR－α／β鏈引入替代效應(yīng)細(xì)胞或構(gòu)建單鏈TCR。

增強(qiáng)治療性TCR表達(dá)的方法包括：（1）TCR－α和TCR－β鏈轉(zhuǎn)基因的密碼子優(yōu)化，以及（2）改變TCR－α／TCR－β載體配置以?xún)?yōu)化表達(dá)。

減少不良事件

通常，靶向非腫瘤毒性是TAA的主要關(guān)鍵障礙，這種風(fēng)險(xiǎn)促使研究人員更仔細(xì)地研究共同的新抗原。目前，多個(gè)癌基因熱點(diǎn)突變正在被研究作為潛在的TCR靶點(diǎn)，如磷酸肌醇－3－激酶（PI3K）、KRAS和TP53。此外，通過(guò)帶有自殺基因的基因工程化的TCR－T細(xì)胞是采用的一項(xiàng)重要安全措施。顯然，發(fā)展可靠識(shí)別的個(gè)性化、高度特異性和免疫原性的腫瘤抗原靶點(diǎn)對(duì)于減少與TCR－T細(xì)胞治療相關(guān)的不良事件至關(guān)重要。

異體T細(xì)胞的移植物抗宿主病

使用同種異體T細(xì)胞是一個(gè)非常有希望的方案，可以克服制造問(wèn)題、患者相關(guān)免疫細(xì)胞缺陷和治療延遲。為了使用同種異體T細(xì)胞，有必要控制由轉(zhuǎn)導(dǎo)的同種反應(yīng)性淋巴細(xì)胞引起的移植物抗宿主病以及宿主免疫系統(tǒng)對(duì)工程化淋巴細(xì)胞的排斥。

內(nèi)源性TCR基因、HLA－I位點(diǎn)或CD52分子的缺失是避免TCR－T移植失敗的策略之一，可通過(guò)多種方法實(shí)現(xiàn)，如基因編輯或使用siRNA。此外，多能干細(xì)胞技術(shù)也被認(rèn)為是一種潛在的解決方案。

小結(jié)

近年來(lái)，工程化T細(xì)胞在治療血液瘤方面顯示出極為優(yōu)越的療效。TCR調(diào)節(jié)對(duì)于T細(xì)胞的再活化、免疫應(yīng)答及其對(duì)外來(lái)抗原的臨床效應(yīng)至關(guān)重要。而TCR－T細(xì)胞具有CAR－T無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)，在臨床前和臨床研究中顯示出巨大的潛力。

然而，提高TCR－T免疫治療的抗腫瘤療效仍然有幾個(gè)關(guān)鍵挑戰(zhàn)，包括如何安全地增加治療性TCR的親和力，如何在患者群體中鑒定共有的腫瘤特異性抗原和TCR，以及如何調(diào)節(jié)TCR的表達(dá)并實(shí)現(xiàn)最佳功能。這些問(wèn)題的解決將有助于充分發(fā)揮TCR－T細(xì)胞治療的潛力，給腫瘤患者解除病痛帶來(lái)希望。

參考文獻(xiàn)：

1．Engineered TCR－T CellI mmunotherapy in Anticancer Precision Medicine： Pros and Cons． Front Immunol． 2021；12： 658753．

2． Evolution of CD8＋ T Cell Receptor（TCR） Engineered Therapies for the Treatment of Cancer． Cells． 2021 Sep；10（9）： 2379．

       原文標(biāo)題 : 帶你全面了解TCR-T細(xì)胞治療