前言

以嵌合抗原受體（CARs）為基礎(chǔ)的T細(xì)胞治療已顯示出對血癌的巨大成功；然而，潛在的致命毒性（如細(xì)胞因子釋放綜合征）和高成本是限制CAR－T細(xì)胞臨床應(yīng)用的一些缺點(diǎn)，有待克服。

自然殺傷（NK）細(xì)胞是當(dāng)前免疫學(xué)研究的焦點(diǎn)，迄今為止，利用NK細(xì)胞治療惡性腫瘤已經(jīng)取得了一定的成功。NK細(xì)胞受體生物學(xué)的最新進(jìn)展極大地改變了我們對NK細(xì)胞如何識別和殺死腫瘤細(xì)胞的理解。CAR－NK細(xì)胞由于其獨(dú)特的識別機(jī)制、強(qiáng)大的細(xì)胞毒性作用以及臨床安全性，成為癌癥再靶向治療的強(qiáng)力候選。此外，NK細(xì)胞降低了同種異體反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，可以作為“現(xiàn)成產(chǎn)品”。

雖然目前如火如荼的CAR－NK療法依然面臨著許多挑戰(zhàn)和障礙，但其巨大的潛力已經(jīng)在腫瘤免疫治療領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的前景。

NK細(xì)胞生物學(xué)

NK細(xì)胞是第一個(gè)被鑒定的先天性淋巴細(xì)胞（ILC）亞型，能對病毒感染和／或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞產(chǎn)生多種效應(yīng)器功能，主要是細(xì)胞殺傷和產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子。NK細(xì)胞和其他ILC家族成員（ILC1s、ILC2s和ILC3s）與B細(xì)胞和T細(xì)胞來源于相同的淋巴祖細(xì)胞。NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性使它們在功能上與CD8＋T細(xì)胞最為相似，而ILC1、ILC2和ILC3群體的細(xì)胞因子生成模式將這些細(xì)胞分別對應(yīng)CD4＋T細(xì)胞的TH1、TH2和TH17亞群。

NK細(xì)胞的兩個(gè)最典型的亞群是CD56brightCD16－和CD56dimCD16＋群體。CD56bright細(xì)胞在外周血中的數(shù)量較少（循環(huán)中90％的NK細(xì)胞是CD56dim），而組織中的NK細(xì)胞主要是CD56bright。CD56bright NK細(xì)胞是強(qiáng)有力的細(xì)胞因子產(chǎn)生者，除非受到促炎性細(xì)胞因子如IL－15的刺激，否則細(xì)胞毒性較弱。相比之下，CD56dim NK細(xì)胞群可介導(dǎo)感染細(xì)胞和惡性細(xì)胞的連續(xù)殺傷，主要通過包含顆粒酶B和穿孔素的預(yù)先組裝的溶細(xì)胞顆粒在免疫突觸中的胞吐，最終誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡。

NK細(xì)胞的激活和抑制性受體

與B細(xì)胞和T細(xì)胞不同，NK細(xì)胞不表達(dá)體細(xì)胞重排的抗原受體，而是激活受體和抑制受體的隨機(jī)組合。通過這些不同受體的刺激信號與抑制信號的平衡產(chǎn)生對靶細(xì)胞的反應(yīng)或耐受。MHC－I（主要組織相容性復(fù)合物Ⅰ類）抗原特異性的抑制性受體可密切調(diào)節(jié)NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性和淋巴因子的產(chǎn)生。MHC－I特異性受體的抑制信號對于造血細(xì)胞避免NK細(xì)胞的破壞至關(guān)重要。這個(gè)概念被稱為“丟失自我”，最初是由 Ljunggren和Karre 提出的。這種MHC－I識別抑制性受體形成了NK細(xì)胞表面受體的三個(gè)家族，即KIRs（殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體）、LIRs（白細(xì)胞免疫球蛋白樣受體）和NKG2A（自然殺傷細(xì)胞2族A）。

KIRs是免疫球蛋白超家族的成員，是識別經(jīng)典人類白細(xì)胞抗原A、B和C（HLA－Ia類）的I型跨膜分子。LIRs又稱ILTs（免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)錄物），形成第二組受體，除了HLA Ia類外，主要識別非經(jīng)典HLA－G（Ib類）分子。LIRs與KIRs屬于同一個(gè)Ig超家族。NKG2A是NKG2族的一個(gè)成員，包括A、B、C、D、E、F和H，與CD94二聚形成NKG2A／CD94受體。它屬于受體的C型凝集素家族，識別非經(jīng)典HLA－EⅠ類分子作為其配體。

NK細(xì)胞的殺傷作用不僅需要通過抑制性受體檢測轉(zhuǎn)化細(xì)胞上的MHC－I分子，還需要通過激活性受體激活NK細(xì)胞。自然細(xì)胞毒性受體（NCR）是一組自然殺傷細(xì)胞表面激活性受體，包括NKp46、NKp30和NKp44。這些受體以及NKG2D和DNAM－1（DNAX輔助分子－1）識別病毒感染或惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞表面表達(dá)的配體。一些共受體（2B4、NKp80、NTB－A和CD59）也被表達(dá)，它們只有與其他激活性受體結(jié)合才能發(fā)揮作用。CD16（或FcγRIII）也是一種激活性受體，主要由CD56dim NK細(xì)胞亞群表達(dá)，對IgG包被靶細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞毒性（ADCC）至關(guān)重要。

CAR－T和CAR－NK

CAR－NK細(xì)胞和CAR－T細(xì)胞一樣存在胞外、跨膜和胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域。NK細(xì)胞通過另外兩個(gè)共刺激分子，即NKG2D和CD244（2B4）增加其細(xì)胞毒性能力和細(xì)胞因子的產(chǎn)生。因此，比CAR－T細(xì)胞具有更強(qiáng)的腫瘤特異性靶向性和細(xì)胞毒性。CAR－NK細(xì)胞療法可能在未來成為CAR－T療法的替代方案，因?yàn)镃AR－NK細(xì)胞具有以下超越CAR－T的幾個(gè)獨(dú)特特征。

首先，異基因NK細(xì)胞對于過繼性細(xì)胞治療（ACT）是相當(dāng)安全的，因?yàn)樗鼈兺ǔ２唤閷?dǎo)發(fā)生GVHD。此外，NK細(xì)胞僅分泌少量IFN－γ和GM－CSF，不產(chǎn)生啟動(dòng)CRS的IL－1和IL－6。其次，除了通過單鏈抗體識別腫瘤表面抗原來抑制癌細(xì)胞外，NK細(xì)胞還可以通過多種受體識別各種配體來抑制癌細(xì)胞，例如自然細(xì)胞毒性受體（NKp46、NKp44和NKp30）、NKG2D和DNAM－1（CD226）。最后，NK細(xì)胞在臨床樣本中非常豐富，可以從外周血（PB）、臍帶血（UCB）、人類胚胎干細(xì)胞（HESC）、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（IPSC）甚至NK－92細(xì)胞系中產(chǎn)生。

CAR－NK細(xì)胞療法的臨床研究

CAR－NK療法的研究目前處于起步階段，臨床研究的數(shù)量逐年增加。此外，在研究的靶標(biāo)方面，CD19抗原在血液腫瘤中最常見。在實(shí)體瘤中進(jìn)展最為廣泛的CAR－NK療法包括腫瘤相關(guān)抗原HER2、MUC1和PMSA等靶點(diǎn)。

目前，一些正在進(jìn)行的臨床試驗(yàn)正在調(diào)查CAR－NK細(xì)胞治療血液學(xué)腫瘤和實(shí)體瘤的安全性和有效性，這些試驗(yàn)在下表列出。

CAR－NK細(xì)胞治療的挑戰(zhàn)

低持久性

在缺乏細(xì)胞因子支持的情況下，輸注細(xì)胞缺乏體內(nèi)持久性是過繼NK細(xì)胞治療的主要缺點(diǎn)之一。雖然它可能更安全的，但它也會限制NK細(xì)胞免疫治療的效果。外源性細(xì)胞因子已被證明能增加過繼性NK細(xì)胞的增殖和耐久性；然而，它們也可能導(dǎo)致不希望的副作用，包括抑制性免疫亞群的生長，如Tregs。

轉(zhuǎn)移到所需的腫瘤部位

快速歸巢到腫瘤床對于過繼性細(xì)胞治療效果至關(guān)重要，并且受NK細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞釋放的趨化因子之間復(fù)雜相互作用的控制。然而，NK細(xì)胞歸巢到腫瘤部位的效率一直存在爭議，因此促使人們不斷努力去進(jìn)行改進(jìn)。

一些研究人員已經(jīng)研究了各種工程方法來改善NK細(xì)胞歸巢。例如，用編碼趨化因子受體CCR7的mRNA電穿孔NK細(xì)胞，以增加向表達(dá)趨化因子CCL19的淋巴結(jié)的移動(dòng)。用編碼CXCR2的病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的NK細(xì)胞對表達(dá)同源配體如CXCL1、CXCL2、CXCL5、CXCL6和CXCL8的腎細(xì)胞癌腫瘤表現(xiàn)出更好的運(yùn)動(dòng)性。為了提高實(shí)體瘤患者NK細(xì)胞免疫治療的成功率，在小鼠模型中研究了幾種促進(jìn)NK細(xì)胞向腫瘤部位轉(zhuǎn)運(yùn)的新技術(shù)；然而，這些方法的有效性還需要在臨床試驗(yàn)中進(jìn)行驗(yàn)證。

免疫抑制腫瘤微環(huán)境

TME包括免疫抑制分子、免疫抑制細(xì)胞和妨礙免疫細(xì)胞功能的不利環(huán)境，是CAR－NK細(xì)胞治療的主要障礙。TGF－β；腺苷；吲哚胺2，3－雙加氧酶（IDO）和前列腺素E2（PGE2）是TME中發(fā)現(xiàn)的可損害NK細(xì)胞活性的免疫抑制細(xì)胞因子和代謝物。Treg細(xì)胞；調(diào)節(jié)性B細(xì)胞；髓源性抑制細(xì)胞；腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）；血小板；成纖維細(xì)胞和一些不利的代謝因素，如缺氧、酸度和營養(yǎng)缺乏，在惡性環(huán)境中會導(dǎo)致免疫抑制。

因此，研究人員正致力于開發(fā)能夠防止某些免疫抑制作用的CAR－NK細(xì)胞。例如，通過使用CRISPR／Cas9技術(shù)敲除TGF－βR2基因或者阻斷NK細(xì)胞上的高親和力A2A腺苷受體。TME導(dǎo)致NK細(xì)胞耗竭的另一個(gè)重要方法是免疫檢查點(diǎn)分子。為了克服這個(gè)問題，基因組編輯被用來消除NK細(xì)胞的檢查點(diǎn)成分，以改善其功能。

慢病毒低轉(zhuǎn)導(dǎo)效率

基于慢病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是細(xì)胞內(nèi)基因修飾和傳遞的最常用的方法之一。然而，由于自然特性，NK細(xì)胞對慢病毒具有抗性，這使得基于慢病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)成為一個(gè)挑戰(zhàn)。為了改進(jìn)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，人們使用了各種化學(xué)物質(zhì)，例如，可以使用魚精蛋白硫酸鹽或葡聚糖去除細(xì)胞膜上的電荷。

CAR－NK細(xì)胞療法的未來展望

識別靶抗原

CARs設(shè)計(jì)中最關(guān)鍵的一步是識別高度一致表達(dá)的靶腫瘤抗原。大多數(shù)腫瘤相關(guān)抗原（TAAs）也由一些健康細(xì)胞表達(dá)，因此，不可避免帶來“靶向非腫瘤”的效應(yīng)。此外，同一腫瘤的單細(xì)胞克隆中這些TAA的表達(dá)可能存在巨大差異。為了克服這個(gè)問題，人們設(shè)計(jì)了雙特異性CAR，可以同時(shí)靶向多個(gè)抗原。

這可以通過多種方式實(shí)現(xiàn)，例如，可以同時(shí)注射針對不同抗原的不同CAR－NK細(xì)胞；或者設(shè)計(jì)一種能夠識別多種抗原的CAR，這一目標(biāo)可以通過“串聯(lián)CAR”實(shí)現(xiàn)，其中兩個(gè)結(jié)合點(diǎn)連接到單個(gè)分子上，以提高免疫突觸的效率。此外，通過使用一個(gè)稱為“雙順反子CAR”的載體可以在同一免疫細(xì)胞上產(chǎn)生多個(gè)CAR。

提高NK細(xì)胞活性

幾個(gè)免疫檢查點(diǎn)調(diào)節(jié)和抑制NK細(xì)胞活性。這些免疫檢查點(diǎn)起到了“天然剎車”的作用，以防止自身免疫疾病或過度激活引起的免疫病理狀況。這些檢查點(diǎn)的基因缺失或阻斷可以幫助CAR－NK細(xì)胞保持過度活躍，更快地?cái)[脫癌癥和轉(zhuǎn)移。

例如，一種新的NK－92細(xì)胞系被設(shè)計(jì)成靶向PD－L1、ER保留的IL－2和高親和力CD16的CAR，稱為PD－L1靶向haNK（t－h(huán)aNK）。令人興奮的臨床前數(shù)據(jù)表明，這些細(xì)胞在體外對15種腫瘤細(xì)胞株具有特異的抗腫瘤作用，在體內(nèi)對三陰性乳腺癌、膀胱腫瘤和肺癌具有很強(qiáng)的抗腫瘤作用。

另一個(gè)提高CAR－NK細(xì)胞活性的重要策略是腫瘤代謝的調(diào)節(jié)，但這一策略尚未得到應(yīng)有的重視。在缺氧條件下，腺苷是通過CD39和CD73代謝ATP產(chǎn)生的，它們參與免疫逃避，阻止NK細(xì)胞運(yùn)輸?shù)侥[瘤部位，并阻止NK細(xì)胞成熟。NKG2D工程化的CAR－NK細(xì)胞在抗CD73抗體抑制后顯示出治療肺癌的良好效果。

克服免疫抑制微環(huán)境

腫瘤具有多種免疫抑制因子，如TGF－β、IL－10、PD－1或精氨酸酶。有幾種方法可以降低TGF－β的抑制作用。例如，TGF－β激酶抑制劑和NK細(xì)胞的組合被發(fā)現(xiàn)可以恢復(fù)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性，并且保留NKG2D和CD16的表達(dá)。此外，使用帶有細(xì)胞外TGF－β受體結(jié)構(gòu)域的混合型CARs已被發(fā)現(xiàn)在提高NK－92細(xì)胞的抗腫瘤潛能方面相當(dāng)成功。通過敲除實(shí)體瘤中的SMAD3，NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性已得到增強(qiáng)。

提高安全性

提高基于CAR－NK細(xì)胞治療安全性的重要方法可能包括通過加入自殺基因或開發(fā)雙特異性CAR分子來修飾CAR結(jié)構(gòu)，以更好地靶向腫瘤特異性抗原。

CAR－NK細(xì)胞可以以CAR依賴和CAR非依賴的方式同樣靶向腫瘤；因此，NK細(xì)胞的這一特性可以被用來發(fā)揮增強(qiáng)的腫瘤殺傷作用和開發(fā)非信號CAR。這些非信號CAR缺乏直接殺傷信號，但通過促進(jìn)NK細(xì)胞在靶細(xì)胞上的駐留和粘附，可以增強(qiáng)NK細(xì)胞的特異性殺傷。另一個(gè)有趣的策略是設(shè)計(jì)能夠調(diào)節(jié)TME的CAR－NK，這種CAR－NK被命名為“裝甲”CAR－NK細(xì)胞。這些非常特殊的CAR－NK細(xì)胞表達(dá)幾種外源基因，可以調(diào)節(jié)局部TME以防止任何有害影響。

提高可及性

為了克服實(shí)體瘤中CAR－NK細(xì)胞的可及性，可以使用幾種方法，包括局部給藥、腹腔給藥和聚焦超聲引導(dǎo)給藥。例如，在模擬人類胸膜惡性腫瘤的原位模型中發(fā)現(xiàn)胸膜注射非常有效，其功能持續(xù)時(shí)間甚至比靜脈注射獲得的時(shí)間更長。局部給予CAR免疫細(xì)胞也可能有助于減少治療劑量。

小結(jié)

總的來說，NK細(xì)胞免疫生物學(xué)領(lǐng)域的進(jìn)展和進(jìn)步為更好和更新穎的免疫療法奠定了基礎(chǔ)，NK細(xì)胞優(yōu)秀的抗腫瘤作用使其成為細(xì)胞免疫治療的焦點(diǎn)。CAR－NK細(xì)胞療法是一個(gè)很有前途的臨床研究領(lǐng)域，與CAR－T細(xì)胞相比，CAR－NK細(xì)胞具有自己獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，但仍面臨著一些挑戰(zhàn)。這些挑戰(zhàn)包括細(xì)胞的持久性，克服免疫抑制微環(huán)境，以及轉(zhuǎn)導(dǎo)效率等。相信解決好這些問題，基于NK細(xì)胞優(yōu)秀的抗腫瘤血統(tǒng)，極有可能在CAR修飾的武裝下為腫瘤治療帶來新的突破。

參考文獻(xiàn)：

1．CAR－NK Cells： From Natural Basis to Design for Kill． Front Immunol． 2021； 12： 707542．

       原文標(biāo)題 : CAR-NK：癌癥免疫治療的新希望