前言

嵌合抗原受體（CAR）是一種受體蛋白，它賦予免疫細(xì)胞新的能力，以靶向特定的抗原蛋白。CAR-T細(xì)胞治療在血液惡性腫瘤取得了巨大的成就。2017年，美國食品藥物監(jiān)督管理局（FDA）首次批準(zhǔn)了兩種CAR-T療法，即tisagenlecleucel（Kymriah®）和Axicabatagene ciloleucel（Yescarta®），分別用于治療急性淋巴細(xì)胞白血病和彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤。到目前為止，已有6種CAR-T療法得到了批準(zhǔn)。CAR-T細(xì)胞療法作為癌癥治療方面革命性的生物技術(shù)產(chǎn)品，展現(xiàn)出未來征服癌癥的卓越潛力。

然而CAR-T細(xì)胞仍存在一些不足，例如副作用、毒性、T細(xì)胞耗竭，并且在實體瘤的治療中顯示出很低的療效等。目前，以CAR技術(shù)為核心的新型細(xì)胞療法，CAR-NK、CAR-NKT、CAR-巨噬細(xì)胞（CAR-M）、CAR-Treg、CAR-γδT等異軍突起，在免疫治療中展現(xiàn)出廣闊的前景。

CAR-Treg

Treg是T細(xì)胞的一個子集，占CD4+T細(xì)胞總數(shù)的5-10%，具有維持體內(nèi)平衡和預(yù)防自身免疫的功能，其特征是CD4、CD25、FOXP3和低水平CD127的共同表達。高水平的FOXP3和特異性去甲基化區(qū)域（TSDR）的去甲基化是Treg的顯著特征，TSDR是FOXP3基因中的一個保守區(qū)域。

與TCR-Treg相比，CAR-Treg具有一些獨特的優(yōu)勢：這些表達CARs的T細(xì)胞激活時繞過HLA限制，通過共受體信號的激活增加了特異性，以及CARs的靶向靈活性（任何可溶性或表面多價抗原都可以作為靶點）。

CAR-Treg細(xì)胞最直接的應(yīng)用是GvHD和器官移植排斥反應(yīng)。與大多數(shù)自身免疫性疾病不同，移植中有非常明確的靶點，即HLA分子。2016年，首次報道了HLA-A2CAR Treg細(xì)胞，研究證明，HLA-A2-CAR-Treg細(xì)胞抑制Teff細(xì)胞增殖，并在免疫缺陷NSG小鼠模型中阻止了HLA-A2+PBMC介導(dǎo)的GvHD。

通過鑒定合適的靶抗原，CAR-Treg的應(yīng)用可以擴展到更多的自身免疫性疾病，如自身免疫性肝�。ˋILD）、I型糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、炎癥性腸病等；此外，CAR Tregs也已用于治療其他疾病，如血友病A、白癜風(fēng)、哮喘、心血管疾病和衰老相關(guān)疾病。

CAR-γδT

γδT細(xì)胞是先天性T淋巴細(xì)胞的一個亞群，含有由γ鏈和δ鏈組成的TCR。它們占循環(huán)T細(xì)胞的0.5-5%，與αβT細(xì)胞相比，它們表現(xiàn)出更少的克隆擴增和TCR多樣性。人類外周血γδT細(xì)胞主要表達Vδ2鏈和Vγ9鏈，在識別磷酸化抗原（PAG）時被激活，具有強大的抗腫瘤細(xì)胞溶解活性。γδT細(xì)胞通過不同的機制和受體發(fā)揮其強大的抗腫瘤活性：它們分泌細(xì)胞毒性分子，如穿孔素和顆粒酶，或表達凋亡誘導(dǎo)配體，如TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）和Fas配體（FasL），以直接殺死腫瘤細(xì)胞。

CAR-γδT的臨床前研究發(fā)現(xiàn)，在體外與陰性的CAR-γδT細(xì)胞相比，帶有CD19特異性CAR-γδT細(xì)胞增強了對CD19+腫瘤細(xì)胞的殺傷，在小鼠模型中減少了CD19+白血病異種移植物。目前，一些臨床研究正在進行中。CAR-γδT細(xì)胞有望成為一種新型的γδT細(xì)胞免疫療法。

CAR-MAIT

粘膜相關(guān)不變T細(xì)胞（MAIT）是一種獨特的、進化上保守的、先天樣T細(xì)胞亞群，在肝臟和粘膜組織中富集。MAIT細(xì)胞表達半不變的αβTCR，其識別由非多態(tài)性MHC I類相關(guān)分子MR1呈遞的非肽抗原。作為一種非經(jīng)典的細(xì)胞毒性T細(xì)胞亞群，MAIT細(xì)胞通過分泌穿孔素、顆粒酶B、表達TRAIL和FasL或產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，如IFN-γ、TNF、GM-CSF和IL-17，與中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和其他效應(yīng)T細(xì)胞相互作用，顯示出強大的細(xì)胞毒性活性。

MAIT細(xì)胞具有一些有利的特性，使其成為CAR的優(yōu)秀候選者。首先，它們在人體組織中含量豐富，占肝臟淋巴細(xì)胞的45%。它們在人類成年血液中也有很多，占循環(huán)T細(xì)胞的10%。其次，MAIT細(xì)胞具有內(nèi)在效應(yīng)記憶表型（CD45RA-CD45RO+CD62LlowCD161+),具有在激活時迅速產(chǎn)生免疫反應(yīng)的能力。第三，由于組織歸巢標(biāo)記物（CCR5、CCR6、CCR9和CXCR6）的高表達，它們對外周組織具有內(nèi)在的遷移能力。鑒于MAIT細(xì)胞主要存在于肝臟和粘膜相關(guān)的外周組織中，如肺、胃腸道、結(jié)腸和宮頸，在這些組織中發(fā)生的癌癥可能更適合基于MAIT細(xì)胞的治療。此外，由于MAIT細(xì)胞是不受MHC限制的，它們不太可能誘導(dǎo)GvHD，因此作為異基因免疫療法開發(fā)的平臺具有巨大潛力。

臨床前研究表明，靶向CD19和HER2的CAR-MAIT表現(xiàn)出與其CAR-T對應(yīng)物相似的細(xì)胞毒性，在某些情況下具有顯著更高的細(xì)胞毒性，同時具有更好的安全性。然而，目前還沒有注冊的臨床試驗測試CAR-MAIT。

CAR-NKT

NKT細(xì)胞是脂質(zhì)和糖脂反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的一個子集，共表達與NK細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)記物（NKp46，NK1.1）。NKT細(xì)胞在腫瘤免疫監(jiān)測和抗腫瘤免疫中起著重要作用。與MHC I或II識別肽抗原的傳統(tǒng)T細(xì)胞不同，NKT細(xì)胞識別通過MHC I樣分子CD1d呈遞的內(nèi)源性和外源性糖脂。

iNKT細(xì)胞具有幾個有利的特性，包括通過直接細(xì)胞毒性或αβT細(xì)胞交叉啟動發(fā)揮強大的抗腫瘤功能；有效運輸?shù)侥[瘤部位的天然能力；以CD1d依賴的方式破壞TAMs和髓系衍生抑制細(xì)胞（MDSCs）的抑制活性；通過NKRs以獨立于CD1d的方式對TAMs的識別和細(xì)胞毒性殺傷；以及由于缺乏MHC參與而沒有GvHD的風(fēng)險。

目前，靶向CSPG4、GD2和CD19的CAR-NKT細(xì)胞已經(jīng)開發(fā)出來，靶向GD2和CD19的CAR-NKT細(xì)胞正在進行臨床試驗。一項I期臨床試驗（NCT03294954）已經(jīng)開始，檢測難治性神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的抗GD2 CAR-NKT細(xì)胞的療效和安全性。初步結(jié)果表明，10名入選患者的治療是安全的，其中1名完全緩解，1名部分緩解，3名患者病情穩(wěn)定。CD19 CAR-NKT細(xì)胞正在進行一項I期臨床試驗（NCT03774654），檢測復(fù)發(fā)和難治性B細(xì)胞惡性腫瘤中的安全性和有效性。

CAR-NK

CAR-NK與CAR-T相比，NK細(xì)胞通過另外兩個共刺激分子，即NKG2D和CD244（2B4）增加其細(xì)胞毒性能力和細(xì)胞因子的產(chǎn)生。因此，比CAR-T細(xì)胞具有更強的腫瘤特異性靶向性和細(xì)胞毒性。CAR-NK細(xì)胞療法可能在未來成為CAR-T療法的替代方案，因為CAR-NK細(xì)胞具有以下超越CAR-T的幾個獨特特征。

首先，異基因NK細(xì)胞對于過繼性細(xì)胞治療（ACT）是相當(dāng)安全的，因為它們通常不介導(dǎo)發(fā)生GVHD。此外，NK細(xì)胞僅分泌少量IFN-γ和GM-CSF，不產(chǎn)生啟動CRS的IL-1和IL-6。其次，除了通過單鏈抗體識別腫瘤表面抗原來抑制癌細(xì)胞外，NK細(xì)胞還可以通過多種受體識別各種配體來抑制癌細(xì)胞，例如自然細(xì)胞毒性受體（NKp46、NKp44和NKp30）、NKG2D和DNAM-1（CD226）。最后，NK細(xì)胞在臨床樣本中非常豐富，可以從外周血（PB）、臍帶血（UCB）、人類胚胎干細(xì)胞（HESC）、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（IPSC）甚至NK-92細(xì)胞系中產(chǎn)生。

目前，在臨床研究方面， CD19-CAR-NK細(xì)胞對血液系統(tǒng)腫瘤有很高的應(yīng)答率。除了CD19外，淋巴瘤和白血病的CAR-NK細(xì)胞臨床研究也針對CD7（NCT02742727）和CD33（NCT02944162）。目前，有幾種針對血液惡性腫瘤的CAR-NK細(xì)胞臨床試驗正在進行中。

還有多項針對實體瘤的研究處于啟動或招募階段。

CAR-M

鑒于CAR-T細(xì)胞治療的成功和CAR-NK細(xì)胞的發(fā)展?jié)摿Γ�研究人員對開發(fā)用于腫瘤免疫治療的CAR巨噬細(xì)胞（CAR-M）產(chǎn)生了極大的興趣。CAR-M的出現(xiàn)為治療實體瘤開辟了新的可能性：用特異性CARs修飾人巨噬細(xì)胞，以提高巨噬細(xì)胞對腫瘤的吞噬活性和抗原呈遞。

CAR-T治療實體瘤無效的一個重要原因是T細(xì)胞難以進入腫瘤組織。這是因為實體瘤細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）形成的物理屏障阻止了T細(xì)胞進入腫瘤組織。ECM由高度有序的纖維分子、糖蛋白和其他大分子產(chǎn)生，其合成和降解主要受基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）和金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）的調(diào)控，而巨噬細(xì)胞就是MMP的重要來源。

目前，在臨床方面，兩個基于CAR-M策略的臨床試驗已經(jīng)獲得FDA的批準(zhǔn)。第一個是來自CARISMA Therapeutics的候選藥物CT-0508，它用抗HER2的CAR-M治療復(fù)發(fā)/難治性HER2過度表達的腫瘤患者（I期臨床試驗）。另一個是Maxyte的MCY-M11，它利用mRNA轉(zhuǎn)染PBMC表達靶向間皮素的CAR（包括CAR-M），治療復(fù)發(fā)/難治性卵巢癌和腹膜間皮瘤患者，目前正在招募志愿者進行I期臨床試驗。

CAR-Neutrophils

中性粒細(xì)胞，以CD11b+CD16+CD66b+為特征，占到了循環(huán)中淋巴細(xì)胞的50-70%，在先天免疫反應(yīng)中發(fā)揮基礎(chǔ)作用。中性粒細(xì)胞也積聚在許多類型的腫瘤中，構(gòu)成腫瘤浸潤細(xì)胞的重要部分�？紤]到中性粒細(xì)胞與巨噬細(xì)胞的相似性和共同的先天抗腫瘤反應(yīng)，在CAR工程化后，中性粒細(xì)胞也可能表現(xiàn)出增強的抑瘤活性。

已有的研究表明，經(jīng)改造表達含有CD3ζ細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的HIV特異性嵌合免疫受體（CIR）的中性粒細(xì)胞對轉(zhuǎn)染HIV包膜的腫瘤細(xì)胞顯示出改善的細(xì)胞毒性。然而，由于中性粒細(xì)胞對基因修飾具有抗性，壽命短，目前還沒有注冊的臨床試驗測試CAR特異性中性粒細(xì)胞。

CAR-HSPC

造血干/祖細(xì)胞（HSPCs），定義為CD34+細(xì)胞，通過自我更新和分化為成熟血細(xì)胞系，對終身維持造血至關(guān)重要。CAR對人HSPC的修飾為多個造血譜系的抗原特異性細(xì)胞提供了長期維持。轉(zhuǎn)導(dǎo)的HSPCs將在1-2周內(nèi)產(chǎn)生粒細(xì)胞和單核細(xì)胞，隨后在幾個月內(nèi)產(chǎn)生NK細(xì)胞，并可能在更長的時間內(nèi)產(chǎn)生T淋巴細(xì)胞。這些細(xì)胞的CAR表達可能通過不斷生成的效應(yīng)細(xì)胞類型的混合來實現(xiàn)持久的抗腫瘤免疫。

有研究用抗CD19 CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)CB衍生的HSPCs，然后將其分化為髓系細(xì)胞或NK細(xì)胞。他們觀察到，由抗CD19 CAR修飾的HSPC產(chǎn)生的髓系細(xì)胞在體外對CD19陽性腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出特異性細(xì)胞毒性。體內(nèi)實驗還表明，CAR HSPCs可以產(chǎn)生多譜系CAR修飾的細(xì)胞，這些細(xì)胞可以在異種移植物模型的骨髓、脾臟和外周血中檢測到。然而，目前還沒有注冊的測試CAR特異性HSPCs的臨床試驗。

CAR-iPSC

為建立長期免疫記憶的CAR技術(shù)產(chǎn)生無限量T細(xì)胞供應(yīng)，并避免在原代T細(xì)胞體外擴增過程中出現(xiàn)的耗竭，一種方法是使用人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）作為起始材料。從幾乎任何體細(xì)胞中獲得iPSC的可能性、無限量生產(chǎn)iPSC的可及性以及iPSC基因修飾的可行性使其成為CAR技術(shù)的極富吸引力的細(xì)胞來源。

Fate Therapeutics公司開發(fā)了兩種CAR iPSC衍生T細(xì)胞產(chǎn)品，F(xiàn)T819和FT873。在FT819中，一種攜帶CD3ζ和CD28共刺激結(jié)構(gòu)域的新型抗CD19 CAR被插入到TRAC基因的兩個等位基因中，以實現(xiàn)均勻的CAR表達，并通過使TCR無效來消除GvHD的可能性。FT819在體外B-ALL異種移植物模型中顯示出有希望的結(jié)果，目前是第一種接受臨床研究的iPSC衍生T細(xì)胞療法（NCT04629729）。

參考文獻：

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3. Natural Born Killers: NK Cells in Cancer Therapy. Cancers (Basel). 2020 Jul 31;12(8):2131

4. CAR-macrophage: A newimmunotherapy candidate against solid tumors. Biomed Pharmacother. 2021 Jul;139:111605.   

       原文標(biāo)題 : 無所不CAR: 細(xì)數(shù)CAR免疫療法的新細(xì)胞來源