前言 

人類自然殺傷細(xì)胞(NK) 占所有循環(huán)淋巴細(xì)胞的15%。NK細(xì)胞發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)70年代，主要與殺死感染的微生物和惡性轉(zhuǎn)化的同種異體和自體細(xì)胞有關(guān)。NK細(xì)胞表現(xiàn)出抗腫瘤細(xì)胞毒性，無需事先致敏和產(chǎn)生細(xì)胞因子以及調(diào)節(jié)各種免疫反應(yīng)的趨化因子。人外周血NK細(xì)胞可分為CD56bright和CD56dim兩大類。CD56brightNK細(xì)胞通常被認(rèn)為是低細(xì)胞毒性的細(xì)胞因子產(chǎn)生細(xì)胞，而CD56dimNK細(xì)胞則具有潛在的細(xì)胞毒性。由于NK細(xì)胞能夠識別和分解腫瘤細(xì)胞，以NK細(xì)胞為基礎(chǔ)的腫瘤免疫治療領(lǐng)域已經(jīng)到了一個激動人心的關(guān)頭。

嵌合抗原受體（CAR）是一種受體蛋白，它賦予免疫細(xì)胞新的能力，以靶向特定的抗原蛋白。它的細(xì)胞外抗原結(jié)合域通常為單鏈抗體（scFv），可以識別腫瘤細(xì)胞表面的特異性抗原。細(xì)胞內(nèi)激活的信號結(jié)構(gòu)域，如CD28、4-1BB（CD137）和OX40，通常起到觸發(fā)免疫細(xì)胞激活和殺傷的作用。表達(dá)CAR的T細(xì)胞能迅速識別腫瘤表面抗原，進(jìn)而裂解腫瘤細(xì)胞。CAR-T細(xì)胞免疫治療在治療急性淋巴細(xì)胞白血�。ˋLL）、慢性淋巴細(xì)胞白血�。–LL）和淋巴瘤等血液腫瘤方面取得了巨大的成就。

然而盡管CAR-T細(xì)胞免疫治療技術(shù)發(fā)展迅速，但在臨床應(yīng)用中仍存在一些不足，例如在實體瘤的治療中顯示出很低的療效；此外，大多數(shù)的CAR-T細(xì)胞免疫療法需要自體過繼細(xì)胞移植，因為除非處理HLA屏障，否則異基因T細(xì)胞可能導(dǎo)致移植物抗宿主�。℅VHD）；另外，CAR-T細(xì)胞免疫治療可能會產(chǎn)生一些副作用，對患者的生命造成危害，如細(xì)胞因子釋放綜合征。最新的研究表明，表達(dá)CAR的NK細(xì)胞可能會克服CAR-T細(xì)胞的上述缺陷，并顯示出顯著的抗腫瘤作用。CAR-NK細(xì)胞在腫瘤的免疫治療中展現(xiàn)出廣闊的前景。

CAR結(jié)構(gòu)的設(shè)計

NK細(xì)胞上表達(dá)的功能性CAR分子由三部分組成：胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)以及胞內(nèi)的信號結(jié)構(gòu)域。胞外結(jié)構(gòu)域由一個信號肽和識別抗原的單鏈抗體片段（scFv）組成，一段鉸鏈區(qū)將這個結(jié)構(gòu)連接到跨膜區(qū)，它也在細(xì)胞內(nèi)連接到包含激活信號的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。成功的CAR設(shè)計是通過仔細(xì)的設(shè)計和功能測試相結(jié)合來實現(xiàn)的。

載體骨架和啟動子

載體骨架包含表達(dá)CAR所需的所有元件，如啟動子、polyA信號和轉(zhuǎn)錄調(diào)控片段。

啟動子的選擇直接影響到轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平。目前，對不同啟動子在NK細(xì)胞系中的CAR表達(dá)和功能的比較只有一次報道，而對原代NK細(xì)胞沒有比較數(shù)據(jù)。就這一次單個報告來看，還不能確定CAR-NK細(xì)胞的最佳啟動子。

目前關(guān)于CAR-NK細(xì)胞的報道顯示，多種啟動子被用于驅(qū)動CAR的表達(dá)，無論是細(xì)胞系來源的還是原代NK細(xì)胞。在原代CAR-NK和CAR-NK細(xì)胞系中，病毒啟動子（CMV、MPSV、MMLV、SFFV等）比組成性活性啟動子（如EF1α、CMV和PGK）更常用。

信號肽

在信號肽中存在著巨大的異質(zhì)性，這直接轉(zhuǎn)化為不同水平的蛋白質(zhì)分泌效率。對于CAR-NK和CAR-T細(xì)胞，還沒有確定最佳信號肽的比較研究。目前，CD8a-SP是原代NK細(xì)胞最常用的信號肽序列（16%，71%的研究中未公布）和NK細(xì)胞系的免疫球蛋白重鏈或輕鏈信號肽（29%）。

單鏈抗體

單鏈抗體片段是CAR的腫瘤抗原結(jié)合域，該結(jié)構(gòu)域?qū)�決定CAR-NK細(xì)胞的特異性和功能。

由于單鏈抗體不是抗體的天然形式，因此重鏈和輕鏈的順序是人工確定的。到目前為止，對于CAR-NK設(shè)計，大多數(shù)更喜歡VH-VL方向，而不是VL-VH方向。Fujiwara等人證明重鏈和輕鏈的順序不影響T細(xì)胞上抗KDR CAR的表達(dá)水平。

此外，細(xì)胞可以配備多個單鏈抗體，從而擴大CAR效應(yīng)細(xì)胞的抗原識別能力。在這里，有多種選擇：CARs可以用雙元件的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)兩個CAR結(jié)構(gòu)的表達(dá)；或者將兩個單鏈抗體融合在一個結(jié)構(gòu)中，產(chǎn)生串聯(lián)單鏈抗體的“單柄”CAR。雖然這些技術(shù)已用于生產(chǎn)CAR-T細(xì)胞，但CAR-NK細(xì)胞仍未知。

目前大多數(shù)臨床CAR-T細(xì)胞試驗都使用了來自小鼠抗體的單鏈抗體，這增加了抗小鼠IgG細(xì)胞宿主抗移植物病的風(fēng)險，這個問題可以通過人源化或篩選全人抗體避免。然而不幸的是，由于這些CAR受體的嵌合特性，即使是人源化的單鏈抗體也可能誘導(dǎo)宿主抗獨特型免疫反應(yīng)。幸運的是，在迄今為止數(shù)量有限的CAR-NK臨床試驗中，沒有發(fā)現(xiàn)與抗CAR免疫反應(yīng)相關(guān)的重大副作用。

連接區(qū)

重鏈和輕鏈之間的連接區(qū)有助于穩(wěn)定單鏈抗體的構(gòu)象，過短會導(dǎo)致多聚體的形成，過長可能導(dǎo)致水解或降低VH和VL結(jié)構(gòu)域之間的關(guān)聯(lián)。對于CAR-NK細(xì)胞，五肽GGGGS的多聚體應(yīng)用最為廣泛，通常為3個重復(fù)。另一個旨在增強蛋白水解穩(wěn)定性的連接體是Whitlow“218”連接體：GSTGSGSKPGSGEGSTKG。

目前，雖然大多數(shù)CAR-NK研究沒有提供連接細(xì)節(jié)，但已有的研究報道中，有22項使用了G4S連接，有2項應(yīng)用了218連接。

鉸鏈區(qū)

鉸鏈區(qū)是連接單鏈抗體單位和跨膜結(jié)構(gòu)域的CAR細(xì)胞外結(jié)構(gòu)區(qū)，它通常維持效應(yīng)細(xì)胞中穩(wěn)健的CAR表達(dá)和活性所需的穩(wěn)定性。大多數(shù)CAR-NK構(gòu)建使用CD8α或CD28胞外結(jié)構(gòu)域的衍生物或基于IgG的鉸鏈區(qū)。

鉸鏈區(qū)的類型和長度對CAR的功能活動有重要影響。但是目前大多數(shù)信息全來自CAR-T領(lǐng)域，能否直接轉(zhuǎn)化為CAR-NK還有待證明。

在CD28和CD8α鉸鏈區(qū)之間的直接比較中，發(fā)現(xiàn)CD28更有可能促進(jìn)CAR分子的二聚化，因此，CD28鉸鏈區(qū)的CAR產(chǎn)生的激活刺激更強。雖然這可能是有益的，但也可能導(dǎo)致更嚴(yán)重的副作用。

IgG為基礎(chǔ)的鉸鏈區(qū)也廣泛應(yīng)用于CAR結(jié)構(gòu)。基于IgG鉸鏈區(qū)的一個主要優(yōu)點是結(jié)構(gòu)的靈活性，該結(jié)構(gòu)通常由IgG1或IgG4的FC部分或Fc部分的CH2/CH3結(jié)構(gòu)域組成。鉸鏈區(qū)的長度可以調(diào)節(jié)以適應(yīng)抗原識別，但研究發(fā)現(xiàn)，間隔區(qū)越短，細(xì)胞因子的產(chǎn)生越高，CAR-T細(xì)胞增殖越快，體內(nèi)持久性和抗腫瘤效果越好。

對于CAR-NK細(xì)胞，大多數(shù)研究在原代NK細(xì)胞（16/35）和CAR-NK細(xì)胞系（41/72）中均采用CD8α鉸鏈區(qū)。其它使用的鉸鏈區(qū)包括CD28、IgG Fc結(jié)構(gòu)域和DAP12。

跨膜結(jié)構(gòu)域 

跨膜（TM）結(jié)構(gòu)域連接CAR的胞外結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)激活信號結(jié)構(gòu)域，CAR-NK最常用的TM部分來自CD3ζ、CD8和CD28，但其他如NKG2D、2B4、DNAM1也有被使用。

TM結(jié)構(gòu)域的選擇影響了CAR結(jié)構(gòu)在細(xì)胞功能上的活化程度。通常在NK細(xì)胞上表達(dá)的分子如DNAM-1、2B4和NKG2D的TM會導(dǎo)致更多的CD107a脫顆粒和更高的細(xì)胞毒性，因此，TM的具體來源將決定CAR-NK的活性。

TM結(jié)構(gòu)域的一個重要方面是，最佳TM區(qū)域應(yīng)遵循T細(xì)胞或NK細(xì)胞上跨膜蛋白的蛋白質(zhì)自然取向（N端到C端順序）。NKG2D雖然是一種強大的NK細(xì)胞激活劑，然而，天然NKG2D具有C端到N端的跨膜區(qū)。

目前，CD8α和CD28修飾的TM在原代CAR-NK細(xì)胞中最常見，而CD28是CAR-NK細(xì)胞系的首選TM區(qū)域。

CAR-NK激活信號

CAR的細(xì)胞內(nèi)激活信號的數(shù)量決定了其屬于哪一“代”CAR。

第一代CAR-NK細(xì)胞與CAR-T細(xì)胞一樣，只含有CD3ζ信號。第二代和第三代CAR-NK分別攜帶一個和兩個額外的共刺激信號，共刺激分子通常來源于CD28家族（CD28和ICOS）、TNFR家族（4-1BB、OX40和CD27）或SLAM相關(guān)受體家族（2B4）。到目前為止，唯一公布的CAR-NK臨床試驗采用了第二代CAR-NK構(gòu)建，該構(gòu)建通過加入IL-15表達(dá)和誘導(dǎo)Caspase9增強活性。

目前大多數(shù)CAR結(jié)構(gòu)依賴于CD3ζ鏈信號域，強烈的激活信號對于誘導(dǎo)有效的抗腫瘤反應(yīng)很重要，但也可能導(dǎo)致效應(yīng)細(xì)胞的快速衰竭。因此，共刺激域的組合可用于校準(zhǔn)所需的免疫細(xì)胞反應(yīng)。與基于4-1BB的 CARs相比，基于CD28的CARs表現(xiàn)出更快的效應(yīng)器特征，誘導(dǎo)更高水平的IFN-γ、顆粒酶B、TNF-α。然而，這種強烈的共刺激信號也會導(dǎo)致活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡（AICD）。

相比較，4-1BB-CD3ζ信號優(yōu)先誘導(dǎo)記憶相關(guān)基因和持續(xù)的抗腫瘤活性。原因可能是4-1BB結(jié)構(gòu)域改善了CD28結(jié)構(gòu)域引起的T細(xì)胞耗竭。

如上圖所示，在CAR-NK細(xì)胞系和原代CAR-NK細(xì)胞的研究中，CD3ζ幾乎被普遍用作主要的激活域，其中大約一半攜帶一個額外的激活域，通常添加4-1BB或CD28。至于第三代結(jié)構(gòu)，CD28/4-1BB/CD3ζ的組合是最常用的。

CAR的轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)載體

隨著基因修飾技術(shù)的進(jìn)步，許多方法被用于產(chǎn)生CAR-NK。兩種主要方法是病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)（使用慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒），或轉(zhuǎn)染裸質(zhì)粒DNA、轉(zhuǎn)座酶DNA介導(dǎo)的整合以及mRNA電轉(zhuǎn)。

慢病毒

慢病毒能夠高效地轉(zhuǎn)導(dǎo)周期性和非周期性細(xì)胞，在基因治療領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。迄今為止，已有14篇關(guān)于原代CAR-NK細(xì)胞和44篇關(guān)于CAR-NK細(xì)胞系的研究成功使用慢病毒作為載體。

在臨床前研究中，21項研究使用了第二代病毒，6項研究使用了第三代慢病毒來產(chǎn)生表達(dá)CAR的NK細(xì)胞系（17個未知）。在原代CAR-NK細(xì)胞研究中，5項研究使用了第三代慢病毒，7項研究使用了第二代慢病毒載體（2個未知）。

逆轉(zhuǎn)錄病毒

幾十年來，逆轉(zhuǎn)錄病毒一直被用作基因治療載體。迄今為止，有20項使用CAR-NK細(xì)胞系的研究和15使用原代NK細(xì)胞的研究應(yīng)用了逆轉(zhuǎn)錄病毒。最近的一項I期臨床試驗中，由逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD19 CAR-NK細(xì)胞治療CD19+非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴細(xì)胞白血病。在這項研究中，73%的患者有響應(yīng)，8名患者中有7名獲得完全緩解。此外，在所有劑量水平下，CAR-NK輸注后30天內(nèi)反應(yīng)迅速。經(jīng)過一年的隨訪，仍然可以檢測到擴增的CAR-NK細(xì)胞。輸注后，外周血中的CAR-NK DNA拷貝數(shù)保持穩(wěn)定達(dá)一年之久，這些結(jié)果首次表明逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的CAR-NK細(xì)胞可以在體內(nèi)長期存活。

不同種類的逆轉(zhuǎn)錄病毒被用來產(chǎn)生CAR-NK細(xì)胞。與γ逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒相比，RD114α逆轉(zhuǎn)錄病毒在原代NK細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率上更高。盡管使用不同的逆轉(zhuǎn)錄病毒可以在NK細(xì)胞中獲得長時間穩(wěn)定的CAR表達(dá)，但逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)的安全性仍然是一個值得關(guān)注的問題，尤其是與更安全的慢病毒相比。

mRNA電穿孔

電穿孔CAR編碼mRNA是一種快速、有效但是作用短暫的一種方法。迄今為止，有9個關(guān)于CAR-NK細(xì)胞系和11個原代CAR-NK細(xì)胞研究使用了mRNA電穿孔。

一般來說，擴增或活化的NK細(xì)胞的mRNA轉(zhuǎn)染效率遠(yuǎn)高于新鮮分離的NK細(xì)胞。由于mRNA的合成符合GMP的規(guī)定，并且電穿孔可以在潔凈室中進(jìn)行，因此通過mRNA電穿孔產(chǎn)生符合GMP的CAR-NK是可行的。然而，這種方法的主要缺點是CAR表達(dá)的窗口短暫：電穿孔后，CAR-NK細(xì)胞應(yīng)在7天內(nèi)輸回患者體內(nèi)。

睡美人轉(zhuǎn)座子

基于轉(zhuǎn)座子的系統(tǒng)可以在預(yù)定的位置高效地導(dǎo)入CAR轉(zhuǎn)基因，這是傳統(tǒng)方法所不具備的一個重要優(yōu)勢。轉(zhuǎn)座子主要通過電穿孔導(dǎo)入NK細(xì)胞，然后通過轉(zhuǎn)座子酶整合到宿主基因組中。有兩項研究應(yīng)用轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)來產(chǎn)生CAR-NK細(xì)胞：一項使用NK-92-MI細(xì)胞，另一項研究將轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)染到iPSC細(xì)胞，然后分化成NK細(xì)胞。富集后，抗間皮素CARs在iPSC衍生的NK細(xì)胞上穩(wěn)定表達(dá)，并在卵巢癌小鼠模型中發(fā)揮出作用。

CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9是一種強大的基因改造技術(shù)，這項技術(shù)依賴于將Cas9蛋白與引導(dǎo)RNA一起導(dǎo)入NK細(xì)胞。最初，這種技術(shù)被用于原代NK細(xì)胞，以破壞CD38基因，旨在防止NK細(xì)胞與daratumumab （抗CD38）聯(lián)合使用時的自相殘殺，因為CD38在NK細(xì)胞、多發(fā)性骨髓瘤和AML細(xì)胞上均有表達(dá)。

最近，CRISPR/Cas9被用于引入新基因。在一些采用HDR模板的研究中，使用K562-mIL-21擴增的NK細(xì)胞獲得了超過75%的敲入效率。然而，在新鮮NK細(xì)胞中，敲入效率僅為3–16%�？偟膩碚f，CRISPR/Cas9策略是一種很有前景的技術(shù)，它可以用來精確地刪除、修復(fù)或?qū)�入特定基因，有望產(chǎn)生強大的抗腫瘤NK細(xì)胞。

CAR-NK細(xì)胞免疫治療的優(yōu)勢

首先，在臨床應(yīng)用中，CAR-NK細(xì)胞免疫療法比CAR-T細(xì)胞免疫療法更安全，而且NK細(xì)胞的安全性已在一些臨床領(lǐng)域得到驗證。例如，一些I/II期試驗顯示，同種異體NK細(xì)胞輸注耐受性良好，不會引起GVHD和明顯的毒性。因此，NK細(xì)胞是一種適應(yīng)性更強的CAR載體，而不僅僅局限于自體細(xì)胞。

CAR-T細(xì)胞免疫治療的主要副作用之一是由于CAR-T細(xì)胞的持續(xù)存在而產(chǎn)生的靶向效應(yīng)。相反，CAR-NK細(xì)胞的壽命很短，幾乎不會產(chǎn)生靶向效應(yīng)。另外，NK細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子種類與T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子種類有很大不同�；钴S的NK細(xì)胞通常產(chǎn)生IFN-γ和粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF），而CAR-T細(xì)胞通常通過分泌促炎性細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1和IL-6誘導(dǎo)細(xì)胞因子風(fēng)暴。

第二，除了通過單鏈抗體識別腫瘤表面抗原來抑制癌細(xì)胞外，NK細(xì)胞還可以通過多種受體識別各種配體來抑制癌細(xì)胞，例如自然細(xì)胞毒性受體（NKp46、NKp44和NKp30）、NKG2D和DNAM-1（CD226）。這些NK細(xì)胞受體通常識別在免疫細(xì)胞或長期治療壓力下腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的應(yīng)激誘導(dǎo)配體。此外，NK細(xì)胞通過FcγRIII（CD16）誘導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性。因此，CAR-NK細(xì)胞可通過CAR依賴和NK細(xì)胞受體依賴性途徑抑制癌細(xì)胞，從而消除腫瘤抗原陽性癌細(xì)胞或表達(dá)NK細(xì)胞受體配體的癌細(xì)胞。臨床試驗表明，CAR-T細(xì)胞不能消除高度異質(zhì)性的癌細(xì)胞，但是CAR-NK細(xì)胞能夠有效地殺死長期治療后可能改變其表型的殘留腫瘤細(xì)胞。

最后，NK細(xì)胞在臨床樣本中非常豐富，可以從外周血（PB）、臍帶血（UCB）、人類胚胎干細(xì)胞（HESC）、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（IPSC）甚至NK-92細(xì)胞系中產(chǎn)生。NK-92細(xì)胞提供了一個均勻的細(xì)胞群，并且可以在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下很容易地擴大，以進(jìn)行廣泛的臨床應(yīng)用。但是，由于其腫瘤細(xì)胞系來源，必須在輸注前進(jìn)行輻照。相反，活躍的PB-NK細(xì)胞表達(dá)廣泛的受體，無需輻射即可利用，這使得它們能夠在體內(nèi)生成。來源于iPSCs或hESCs的NK細(xì)胞結(jié)合了PB-NK和NK-92細(xì)胞的優(yōu)點，表現(xiàn)出與PB-NK細(xì)胞相似的表型，是一個同質(zhì)的群體。更重要的是，通過采用非病毒轉(zhuǎn)基因方法，CAR可以很容易地在人胚胎干細(xì)胞和/或iPSC來源的NK細(xì)胞中表達(dá)。

CAR-NK細(xì)胞免疫治療的臨床研究

血液瘤

臨床前研究表明，CD19-CAR-NK細(xì)胞對血液系統(tǒng)腫瘤有很高的應(yīng)答率，并且易于制造，與目前的CAR-T細(xì)胞免疫療法相比，這是一個巨大的進(jìn)步。CD19-CAR修飾的NK細(xì)胞具有比CAR-T更明顯的優(yōu)勢，有望顯示出更好的抗腫瘤作用。除了CD19外，淋巴瘤和白血病的CAR-NK細(xì)胞臨床研究也針對CD7（NCT02742727）和CD33（NCT02944162）。目前，有幾種針對血液惡性腫瘤的CAR-NK細(xì)胞臨床試驗正在進(jìn)行中。

實體瘤

CAR治療的一個主要障礙是缺乏對實體瘤的療效。這是由于腫瘤灌注不良、TAA異質(zhì)性和實體瘤伴發(fā)的免疫抑制腫瘤微環(huán)境（TME）所致。

CAR-NK療法試圖解決這些問題，一些臨床試驗已經(jīng)應(yīng)用于實體惡性腫瘤的治療。在實體瘤中進(jìn)展最為廣泛的CAR-NK療法包括檢查點分子程序性細(xì)胞死亡蛋白-1配體（PD-L1）以及常見的腫瘤相關(guān)抗原HER2和MUC1為靶點。 

PD-L1在TME和免疫抑制細(xì)胞的幾種癌癥類型中上調(diào)。一種新的NK-92細(xì)胞系被設(shè)計成靶向PD-L1、ER保留的IL-2和高親和力CD16的CAR，稱為PD-L1靶向haNK（t-haNK）。令人興奮的臨床前數(shù)據(jù)表明，這些細(xì)胞在體外對15種腫瘤細(xì)胞株具有特異的抗腫瘤作用，在體內(nèi)對三陰性乳腺癌、膀胱腫瘤和肺癌具有很強的抗腫瘤作用。QUITL3.064 I期臨床試驗（NCT04050709）目前正在進(jìn)行，PD-L1 t-haNK聯(lián)合其他藥物評估局部晚期或轉(zhuǎn)移性胰腺癌患者的安全性和有效性也在進(jìn)行中（NCT0439099）。

HER2在幾種癌癥中過度表達(dá)，如乳腺癌、胃癌、食管癌、卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌。HER2也在80%的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表達(dá)，并且與低生存率相關(guān)。因此，HER2是CAR治療的一個非常有吸引力的靶點。HER2-CAR-T治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤已經(jīng)顯示出這些細(xì)胞被轉(zhuǎn)移到腫瘤中，但是在TME中高效應(yīng)功能的T細(xì)胞導(dǎo)致抗原丟失變體的快速選擇。ErbB2-NK-92/5.28z CAR-NK將在潛在抗原丟失的情況下保持效應(yīng)器功能，從而使過繼轉(zhuǎn)移細(xì)胞的細(xì)胞毒功能恢復(fù)到基線NK細(xì)胞的細(xì)胞毒功能。這項HER2-CAR-NK治療正在一項3+3劑量遞增I期臨床試驗（CAR2BRAIN；NCT0338978）中。

MUC1是一種在導(dǎo)管上皮細(xì)胞上表達(dá)的高度糖基化跨膜糖蛋白，其在人類B細(xì)胞和T細(xì)胞上的表達(dá)存在爭議。MUC1在多種癌癥類型中過度表達(dá)，使其成為CAR-T治療的合適靶點。然而，CAR-T療法已被證明是不成功的，因為免疫抑制的TME。為了規(guī)避TME介導(dǎo)的免疫抑制，CAR-NK細(xì)胞被設(shè)計表達(dá)帶有CD28和CD137信號結(jié)構(gòu)域的MUC1-CAR和截短的PD-1肽（MUC1-CAR-NK-92）。這些細(xì)胞在體外和體內(nèi)均能殺傷MUC1靶細(xì)胞。最近完成了一項I期臨床試驗（NCT02839954），評估了Muc1-CAR-NK-92在Muc1陽性復(fù)發(fā)或難治性實體瘤患者中的安全性和有效性。13例PD-L1和MUC1陽性腫瘤患者中，3名退出，9名病情穩(wěn)定，1名患者病情進(jìn)展。主要的觀察指標(biāo)是確定Muc1-CAR-NK-92細(xì)胞的毒性，值得注意的是，試驗中沒有任何患者出現(xiàn)細(xì)胞因子風(fēng)暴或骨髓抑制的跡象。

CAR-NK細(xì)胞治療的挑戰(zhàn)

低持久性

在缺乏細(xì)胞因子支持的情況下，輸注細(xì)胞缺乏體內(nèi)持久性是過繼NK細(xì)胞治療的主要缺點之一。雖然它可能更安全的，但它也會限制NK細(xì)胞免疫治療的效果。外源性細(xì)胞因子已被證明能增加過繼性NK細(xì)胞的增殖和耐久性；然而，它們也可能導(dǎo)致不希望的副作用，包括抑制性免疫亞群的生長，如Tregs。

轉(zhuǎn)移到所需的腫瘤部位

快速歸巢到腫瘤床對于過繼性細(xì)胞治療效果至關(guān)重要，并且受NK細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞釋放的趨化因子之間復(fù)雜相互作用的控制。然而，NK細(xì)胞歸巢到腫瘤部位的效率一直存在爭議，因此促使人們不斷努力去進(jìn)行改進(jìn)。

一些研究人員已經(jīng)研究了各種工程方法來改善NK細(xì)胞歸巢。例如，用編碼趨化因子受體CCR7的mRNA電穿孔NK細(xì)胞，以增加向表達(dá)趨化因子CCL19的淋巴結(jié)的移動。用編碼CXCR2的病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的NK細(xì)胞對表達(dá)同源配體如CXCL1、CXCL2、CXCL5、CXCL6和CXCL8的腎細(xì)胞癌腫瘤表現(xiàn)出更好的運動性。為了提高實體瘤患者NK細(xì)胞免疫治療的成功率，在小鼠模型中研究了幾種促進(jìn)NK細(xì)胞向腫瘤部位轉(zhuǎn)運的新技術(shù)；然而，這些方法的有效性還需要在臨床試驗中進(jìn)行驗證。

免疫抑制腫瘤微環(huán)境

TME包括免疫抑制分子、免疫抑制細(xì)胞和妨礙免疫細(xì)胞功能的不利環(huán)境，是CAR-NK細(xì)胞治療的主要障礙。TGF-β；腺苷；吲哚胺2,3-雙加氧酶（IDO）和前列腺素E2（PGE2）是TME中發(fā)現(xiàn)的可損害NK細(xì)胞活性的免疫抑制細(xì)胞因子和代謝物。Treg細(xì)胞；調(diào)節(jié)性B細(xì)胞；髓源性抑制細(xì)胞；腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）；血小板；成纖維細(xì)胞和一些不利的代謝因素，如缺氧、酸度和營養(yǎng)缺乏，在惡性環(huán)境中會導(dǎo)致免疫抑制。

因此，研究人員正致力于開發(fā)能夠防止某些免疫抑制作用的CAR-NK細(xì)胞。例如，通過使用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除TGF-βR2基因或者阻斷NK細(xì)胞上的高親和力A2A腺苷受體。TME導(dǎo)致NK細(xì)胞耗竭的另一個重要方法是免疫檢查點分子。為了克服這個問題，基因組編輯被用來消除NK細(xì)胞的檢查點成分，以改善其功能。

慢病毒低轉(zhuǎn)導(dǎo)效率

基于慢病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是細(xì)胞內(nèi)基因修飾和傳遞的最常用的方法之一。然而，由于自然特性，NK細(xì)胞對慢病毒具有抗性，這使得基于慢病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)成為一個挑戰(zhàn)。為了改進(jìn)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，人們使用了各種化學(xué)物質(zhì)，例如，可以使用魚精蛋白硫酸鹽或葡聚糖去除細(xì)胞膜上的電荷。

CAR-NK細(xì)胞療法的未來展望

識別靶抗原

CARs設(shè)計中最關(guān)鍵的一步是識別高度一致表達(dá)的靶腫瘤抗原。大多數(shù)腫瘤相關(guān)抗原（TAAs）也由一些健康細(xì)胞表達(dá)，因此，不可避免帶來“靶向非腫瘤”的效應(yīng)。此外，同一腫瘤的單細(xì)胞克隆中這些TAA的表達(dá)可能存在巨大差異。為了克服這個問題，人們設(shè)計了雙特異性CAR，可以同時靶向多個抗原。

這可以通過多種方式實現(xiàn)，例如，可以同時注射針對不同抗原的不同CAR-NK細(xì)胞；或者設(shè)計一種能夠識別多種抗原的CAR，這一目標(biāo)可以通過“串聯(lián)CAR”實現(xiàn)，其中兩個結(jié)合點連接到單個分子上，以提高免疫突觸的效率。此外，通過使用一個稱為“雙順反子CAR”的載體可以在同一免疫細(xì)胞上產(chǎn)生多個CAR。

提高NK細(xì)胞活性

幾個免疫檢查點調(diào)節(jié)和抑制NK細(xì)胞活性。這些免疫檢查點起到了“天然剎車”的作用，以防止自身免疫疾病或過度激活引起的免疫病理狀況。這些檢查點的基因缺失或阻斷可以幫助CAR-NK細(xì)胞保持過度活躍，更快地擺脫癌癥和轉(zhuǎn)移。

例如，一種新的NK-92細(xì)胞系被設(shè)計成靶向PD-L1、ER保留的IL-2和高親和力CD16的CAR，稱為PD-L1靶向haNK（t-haNK）。令人興奮的臨床前數(shù)據(jù)表明，這些細(xì)胞在體外對15種腫瘤細(xì)胞株具有特異的抗腫瘤作用，在體內(nèi)對三陰性乳腺癌、膀胱腫瘤和肺癌具有很強的抗腫瘤作用。

另一個提高CAR-NK細(xì)胞活性的重要策略是腫瘤代謝的調(diào)節(jié)，但這一策略尚未得到應(yīng)有的重視。在缺氧條件下，腺苷是通過CD39和CD73代謝ATP產(chǎn)生的，它們參與免疫逃避，阻止NK細(xì)胞運輸?shù)侥[瘤部位，并阻止NK細(xì)胞成熟。NKG2D工程化的CAR-NK細(xì)胞在抗CD73抗體抑制后顯示出治療肺癌的良好效果。

克服免疫抑制微環(huán)境

腫瘤具有多種免疫抑制因子，如TGF-β、IL-10、PD-1或精氨酸酶。有幾種方法可以降低TGF-β的抑制作用。例如，TGF-β激酶抑制劑和NK細(xì)胞的組合被發(fā)現(xiàn)可以恢復(fù)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性，并且保留NKG2D和CD16的表達(dá)。此外，使用帶有細(xì)胞外TGF-β受體結(jié)構(gòu)域的混合型CARs已被發(fā)現(xiàn)在提高NK-92細(xì)胞的抗腫瘤潛能方面相當(dāng)成功。通過敲除實體瘤中的SMAD3，NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性已得到增強。

提高安全性

提高基于CAR-NK細(xì)胞治療安全性的重要方法可能包括通過加入自殺基因或開發(fā)雙特異性CAR分子來修飾CAR結(jié)構(gòu)，以更好地靶向腫瘤特異性抗原。

CAR-NK細(xì)胞可以以CAR依賴和CAR非依賴的方式同樣靶向腫瘤；因此，NK細(xì)胞的這一特性可以被用來發(fā)揮增強的腫瘤殺傷作用和開發(fā)非信號CAR。這些非信號CAR缺乏直接殺傷信號，但通過促進(jìn)NK細(xì)胞在靶細(xì)胞上的駐留和粘附，可以增強NK細(xì)胞的特異性殺傷。另一個有趣的策略是設(shè)計能夠調(diào)節(jié)TME的CAR-NK，這種CAR-NK被命名為“裝甲”CAR-NK細(xì)胞。這些非常特殊的CAR-NK細(xì)胞表達(dá)幾種外源基因，可以調(diào)節(jié)局部TME以防止任何有害影響。

提高可及性

為了克服實體瘤中CAR-NK細(xì)胞的可及性，可以使用幾種方法，包括局部給藥、腹腔給藥和聚焦超聲引導(dǎo)給藥。例如，在模擬人類胸膜惡性腫瘤的原位模型中發(fā)現(xiàn)胸膜注射非常有效，其功能持續(xù)時間甚至比靜脈注射獲得的時間更長。局部給予CAR免疫細(xì)胞也可能有助于減少治療劑量。

新一代的CAR-NK

一些研究小組正在探索不同的機制來有效地對抗抗原丟失和免疫抑制TME，從而將提高CAR-NK治療策略的治療壽命和療效，并可能成為下一代CAR-NK治療的支柱。

為了避免抗原逃逸，Mitwasi和他的同事開發(fā)了一種通用型CAR（UniCAR），帶有開關(guān)，以提高安全性和可控性。這項技術(shù)首先在針對E5B9的CAR-T細(xì)胞上得到驗證，E5B9是核抗原La-SS/B的肽表位。由于在細(xì)胞表面沒有發(fā)現(xiàn)這種蛋白，CAR-T必須通過一種稱為靶模塊（TM）的雙特異性分子定向到腫瘤。TMs通常以E5B9肽表位融合到抗TAA的單鏈抗體上。不同的TM可以聯(lián)合應(yīng)用，以同時針對多個TAA，誘導(dǎo)CARs反應(yīng)肽的異質(zhì)性，而不存在靶向效應(yīng)的風(fēng)險。

Mitwasi等人開發(fā)了一個表達(dá)UniCAR的NK-92細(xì)胞系和一個TM，其中E5B9表位連接到IgG4主干上的抗GD2單抗。GD2在多種人類腫瘤中高表達(dá)，是神經(jīng)母細(xì)胞瘤的免疫治療靶點之一。以表達(dá)GD2的神經(jīng)母細(xì)胞瘤和黑色素瘤細(xì)胞為靶點的UniCAR NK-92在體外表現(xiàn)出抗腫瘤細(xì)胞毒性，已準(zhǔn)備進(jìn)一步的臨床開發(fā)。

CAR治療面臨的另一個挑戰(zhàn)是TME。為避免免疫抑制性TME，Wang等構(gòu)建了NK-92細(xì)胞，表達(dá)由細(xì)胞外TGFβRII融合到激活受體NKG2D的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)域組成的修飾CAR（TGFβRII-NKG2D，稱為NK-92-TN）。本質(zhì)上，這種融合將免疫抑制劑TME產(chǎn)生的TGF-β傳遞的信號轉(zhuǎn)換為激活信號。體外培養(yǎng)的NK-92-TN細(xì)胞對TGF-β抑制有抵抗力，無NKG2D下調(diào)，TGF-β共培養(yǎng)后殺傷能力和IFN-γ產(chǎn)生增加。雖然體外實驗數(shù)據(jù)看起來很有希望，但在體內(nèi)，NK-92-TN的抗腫瘤活性并不顯著，終點腫瘤重量的減少很小。在這方面還需要更深入的研究。

展望

自然殺傷細(xì)胞是一組獨特的抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞，具有不受MHC限制的細(xì)胞毒性、產(chǎn)生細(xì)胞因子和免疫記憶等功能，使其成為先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)系統(tǒng)中的關(guān)鍵角色。CAR-NK細(xì)胞療法是一個很有前途的臨床研究領(lǐng)域，對某些癌癥患者具有良好的安全性和初步療效。與CAR-T細(xì)胞相比，CAR-NK細(xì)胞具有自己獨特的優(yōu)點，但仍面臨著一些挑戰(zhàn)。這些挑戰(zhàn)包括細(xì)胞增殖的改善，使細(xì)胞毒性的激活更有效，以及最終找到NK細(xì)胞的最佳重建方法。相信解決好這些問題，基于NK細(xì)胞優(yōu)秀的抗腫瘤血統(tǒng)，極有可能在CAR修飾的武裝下為腫瘤治療帶來新的突破。

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4. Chimeric antigen receptornatural killer (CAR-NK) cell design and engineering for cancer therapy. JHematol Oncol. 2021; 14: 73.

       原文標(biāo)題 : CAR-NK的設(shè)計和未來展望