前言

Toll樣受體9（TLR9）是Toll樣受體家族的成員之一，其可被病原體來源的非甲基化磷酸胞苷鳥苷DNA（CpG DNA）或人工合成的含非甲基化CpG的寡核苷酸（CpG ODN）激活，并通過其下游信號傳導直接或間接啟動固有免疫反應，從而抵抗病原體的入侵。

長期以來，TLR9一直被認為是位于內溶酶體中的細胞內DNA傳感器。然而，隨著研究的深入，發(fā)現TLR9也可以在細胞膜表面表達，如中性粒細胞、B細胞甚至紅細胞，被稱為表面TLR9（sTLR9）。此外，細胞免疫反應的激活可以在細胞內外的這兩個TLR9位點啟動，TLR9在細胞膜上的定位有助于激活內體TLR9（eTLR9）介導的信號通路。sTLR9的存在可能有利于某些細胞類型或組織中的宿主反應，例如紅細胞可以通過sTLR9介導巨噬細胞等先天免疫細胞的激活，從而在炎癥狀態(tài)下加速自身的清除。因此，深入了解sTLR9的結構特征、sTLR9與CpGDNA的關系，以及sTLR9在免疫細胞中的免疫調節(jié)作用，將為TLR9激動劑的臨床應用提供理論參考。

sTLR9的結構

sTLR9的結構并不特別清楚，它是否與eTLR9相同也存在爭議。眾所周知，eTLR9屬于I型跨膜蛋白，由細胞外、跨膜和細胞內區(qū)域組成。eTLR9的胞外區(qū)位于內體中，由25個富含亮氨酸的重復序列（LRR）組成，其N-末端和C-末端分別稱為TLR9-N和TLR9-C。TLR9-N和TLR9-C可以通過天冬氨酸內切酶釋放，該內切酶作用于eTLR9中間的LLR14和LLR15之間的Z環(huán)結構域，形成TLR9-N+C復合物，這是eTLR9的活性形式。

然而，sTLR9的結構尚不清楚。一項研究表明，與TLR9-N結合的抗體完全不能與人外周中性粒細胞上的sTLR9結合，這可能表明這些中性粒細胞的sTLR9不是TLR9-N+C復合物的活性形式。而抗全長TLR9和抗TLR9-N的抗體都能識別B細胞上的sTLR9，這表明全長TLR9和TLR9-N存在于B細胞上。此外，識別TLR9-N的抗體可以檢測到樹突狀細胞（DC）上的sTLR9，但檢測不到脾臟中性粒細胞上的sTLR9，這表明DC和中性粒細胞的sTLR9構象不同。這些研究給人的印象是，sTLR9的結構可以是全長無活性形式，也可以是酶水解活性形式，這可能因細胞而異。

sTLR9的轉移

對于細胞內TLR9，它可以位于內質網（ER）或內體的膜上。對于組成性表達TLR9的細胞，如pDC和B細胞，在穩(wěn)態(tài)下，TLR9主要位于ER膜上。然而，當TLR9配體如CpG-ODN刺激時，TLR9可以從ER膜遷移到內溶酶體膜，成為eTLR9。這種重新定位過程依賴于幾種伴侶蛋白，包括Unc93B1、gp96和PRAT4A。Unc93B1是TLR9功能所需的多次跨膜蛋白，是控制TLR9從內質網向內溶酶體運輸的最關鍵的調節(jié)因子。Gp96和PRAT4A也與TLR9相互作用，并共同調控TLR9的折疊。

sTLR9也可以在Unc93B1和銜接蛋白2（AP2）的幫助下從細胞表面遷移到內體，成為eTLR9。研究發(fā)現，細胞膜表面的Unc93B1通過其C末端YxxΦ基序募集AP2，然后與網格蛋白形成復合物，以幫助sTLR9轉運到內溶酶體膜上。在存在TLR9配體（如CpG-ODN）的情況下，sTLR9向IRF信號通路的偏向與I型干擾素的誘導有關，而sTLR9向NF-κB信號通路的偏向則與炎癥因子的誘導有關。

此外，在人pDC中，DC相關LAMP樣分子（BAD-LAMP）與Unc93B1一起，促進TLR9從IRF信號向NF-κB信號的偏移，最終導致促炎細胞因子的產生。目前，尚不清楚CpG DNA是如何產生啟動TLR9轉運信號的，但據推測，不同位點TLR9數量的失衡可能是觸發(fā)TLR9遷移和重新定位的驅動力。

sTLR9與CpG-ODN的關系

到目前為止，sTLR9是否與TLR9配體CpG-ODN結合仍不確定，但對在中性粒細胞、B細胞和紅細胞上表達的sTLR9的幾項研究表明，中性粒細胞上的sTLR9可以直接與CpG-ODN結合并被激活。對HEK293轉染細胞上表達的sTLR9的研究表明，sTLR9參與CpG-ODN刺激中的細胞內信號通路，涉及MyD88、IRAK和TRAF6，表明定位在細胞表面的TLR9具有生物活性。此外，B細胞和紅細胞似乎也有類似的現象。

因此，sTLR9似乎具有識別和結合CpG-ODN的能力，但它是否能直接啟動信號轉導還需要進一步研究。sTLR9是否能夠與TLR9配體結合是一個值得研究的課題，這有助于揭示TLR9在細胞膜表面出現的潛在生理意義，也有助于解釋其在自身免疫性疾病中的可能作用。

sTLR9的免疫調節(jié)作用

sTLR9對中性粒細胞和B細胞的免疫調節(jié)作用已經得到了相對深入的研究。紅細胞作為人類免疫系統(tǒng)中一種新興的研究前沿，也表達sTLR9，它可以激活先天免疫反應。

中性粒細胞

據報道，中性粒細胞能夠在病原體感染早期通過sTLR9介導先天免疫反應。已經發(fā)現，當CpG DNA不能進入內體或eTLR9不能被激活時，表達sTLR9的中性粒細胞可以感知細胞外病原體衍生的CpG DNA，并獨立于eTLR9啟動sTLR9介導的信號傳導。

一些研究表明，sTLR9+中性粒細胞可能在病原體感染中發(fā)揮陽性或陰性免疫調節(jié)作用，這取決于其位置或時間。一項基于D-半乳糖胺（D-GAL）聯合CpG-ODN誘導全身炎癥反應綜合征（SIRS）小鼠模型的研究表明，sTLR9+中性粒細胞可在炎癥部位產生TNF-α和IL-10。然而，SIRS誘導后1小時收集的sTLR9+中性粒細胞比6小時收集的產生更多的IL-10和更少的TNF-α，這表明炎癥初始階段的sTLR9+中性粒細胞可能更傾向于負向的免疫調節(jié)作用。此外，，在腫瘤中，sTLR9+中性粒細胞與免疫抑制分子如PD-L1和IL-10的高表達，以及免疫激活分子如TNF-α和ICAM1的表達減少有關，其比例也隨著腫瘤的進展而增加，提示sTLR9+中性粒細胞具有負性免疫調節(jié)特性。通過使用TLR9激動劑下調早期腫瘤中性粒細胞上sTLR9的水平可以抑制腫瘤生長。

總之，無論是炎癥還是腫瘤，中性粒細胞表面sTLR9的存在似乎都是一種分子標記，可以確定其是否發(fā)揮積極或消極的免疫調節(jié)作用，同時也賦予sTLR9免疫檢查點分子的特征。TLR9可能通過選擇性遷移發(fā)揮免疫檢查點或免疫激活的雙重作用，成為中性粒細胞等先天免疫細胞獨特而快速的活性調節(jié)模式。

B細胞

最近的研究發(fā)現TLR9在B細胞表面表達，并參與B細胞的激活。根據研究報告，與健康對照組相比，膿毒癥患者外周血B細胞中sTLR9的表達顯著增加。sTLR9的激活可以抑制CpG-ODN單獨或與抗IgM抗體聯合誘導的B細胞增殖和CD25表達。在抗IgM抗體結合的B細胞受體（BCR）的情況下，sTLR9轉移到B細胞的脂筏，表明sTLR9可能在B細胞活化過程中分離，并且這種重新定位對于B細胞活化可能是至少部分必需的。

也有研究表明，sTLR9可能是靜息狀態(tài)B細胞拮抗eTLR9激活的一種負調控因子。當B細胞通過eTLR9信號被激活時，sTLR9可以幫助eTLR9發(fā)揮其功能。此外，在一項研究中發(fā)現，在疫苗加CpG-ODN的刺激下，B細胞上的sTLR9內化到細胞并與內涵體膜蛋白共定位，伴隨著B細胞中sTLR9水平的降低和B細胞的活化，揭示了sTLR9在TLR9激動劑的作用下內化為eTLR9。這些數據表明，CpG-ODN介導的B細胞活化的機制之一可能部分在于其誘導sTLR9在B細胞中重新定位，而sTLR9可能是避免TLR9介導過度B細胞激活的負調控因子。

紅細胞

最新研究表明，紅細胞不僅具有運輸氧氣的功能，還具有免疫哨兵的作用，可以及時感知體內病原體或損傷，發(fā)揮免疫細胞的功能。有趣的是，TLR9在紅細胞表面表達，這與先天免疫的激活和炎癥狀態(tài)下紅細胞的加速清除有關。

入侵人體的病原體和受損細胞都可以釋放CpG DNA，因此體內游離CpG DNA水平升高，在惡性腫瘤、自身免疫性疾病和敗血癥中通常可以檢測到。2018年，一項研究表明，紅細胞是清除CpG DNA和減輕肺組織損傷所必需的。sTLR9在人類和小鼠紅細胞表面表達，并能與大量游離CpG DNA結合。CD47與CpGDNA結合后，紅細胞表面的分子構象發(fā)生變化，失去了原來的“不要吃我”的功能。當這些紅細胞穿過包括肝臟和脾臟在內的網狀內皮系統(tǒng)時，它們被巨噬細胞上表達的SIRPα快速識別，然后被巨噬細胞吞噬。因此，紅細胞以自殺傾向的方式清除CpG-DNA，這抑制了過度的炎癥反應，并誘導貧血的發(fā)生。盡管如此，能夠表達sTLR9的紅細胞只占很小的比例，它們在免疫調節(jié)中的作用仍有待進一步研究。

小結

TLR9可能出現在細胞膜上并作為穩(wěn)定和功能性受體的可能性特別令人感興趣。發(fā)現源自細胞表面TLR9的途徑可能揭示內體TLR9新的功能，增強我們對炎癥或癌癥觸發(fā)的理解，并可能發(fā)現以前未知的sTLR9受體特異性配體。存在于質膜上的TLR9可以作為治療靶點，幫助我們開發(fā)針對難以治療的罕見疾病的新治療方法。

參考文獻

1.Surfacetoll-like receptor 9 on immune cells and its immunomodulatory effect. FrontImmunol.2023 Sep 1;14:1259989

       原文標題 : 免疫細胞表面的TLR9及其免疫調節(jié)作用