前言

抗體-寡核苷酸偶聯(lián)藥物（AOCs）是一類由單克隆抗體和寡核苷酸（ONs）組成的新型合成生物偶聯(lián)物，其在現(xiàn)代生物技術(shù)的應(yīng)用中引起了相當(dāng)大的關(guān)注。AOC已被用于開發(fā)免疫測定方法，能夠檢測具有高特異性和敏感性的廣泛生物標(biāo)志物。這些測定包括免疫PCR和鄰近連接分析（PLA），它們依賴于抗體的靶標(biāo)識(shí)別特性和核酸的擴(kuò)增特性。最近，還開發(fā)了幾種技術(shù)來利用AOC作為超分辨率成像劑，從而提高細(xì)胞成像的分辨率和對(duì)比度。

除了生物分析外，AOCs還因其通過表面受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用將包括siRNA、反義RNA和CpG在內(nèi)的遺傳治療有效載荷遞送到靶細(xì)胞中的潛力而受到極大關(guān)注。近年來，生物制藥公司將大量注意力和資源集中在開發(fā)基于AOC技術(shù)的先進(jìn)藥物上。如Avidity、Dyne、Tallac、Denali和Gennao Bio，正在開發(fā)各種肌肉疾病的治療方法，如1型肌強(qiáng)直性營養(yǎng)不良（DM1）、杜氏肌營養(yǎng)不良以及癌癥和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。Avidity的AOC 1001是第一個(gè)進(jìn)入臨床試驗(yàn)的AOC，以siRNA有效載荷靶向轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1（TfR1），用于治療DM1。

盡管AOC在臨床上取得了成功，但高保真偶聯(lián)技術(shù)的發(fā)展是發(fā)現(xiàn)AOC先導(dǎo)化合物的關(guān)鍵部分。在過去的十年里，能夠精確控制AOC位點(diǎn)特異性和化學(xué)計(jì)量的化學(xué)和生物學(xué)方法不斷進(jìn)步。這些技術(shù)得以確�？贵w和寡核苷酸之間的牢固且精確的連接。此外，可及性、偶聯(lián)物穩(wěn)定性和生產(chǎn)效率等參數(shù)在決定臨床候選藥物的成功潛力方面也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

無連接子偶聯(lián)方法

在無連接子偶聯(lián)技術(shù)中，不需要雙特異性連接子作為將靶抗體連接到寡核苷酸上的粘合劑。通常，這種方法涉及對(duì)靶抗體結(jié)構(gòu)的工程設(shè)計(jì)，以提供用于有效載荷ONs順序偶聯(lián)的特定生化處理。

氨基酸偶聯(lián)

無連接子偶聯(lián)的最常見方法包括用特定的天然或非天然氨基酸工程化靶抗體。通過引入特定的氨基酸，可以精確控制有效載荷ONs的數(shù)量和位置，半胱氨酸和谷氨酰胺是用于位點(diǎn)特異性偶聯(lián)的兩種常用氨基酸。

Cuellar et?等人報(bào)道了使用基于半胱氨酸的ThioMab技術(shù)將ONs共價(jià)偶聯(lián)到還原的抗體上，從而促進(jìn)siRNA的遞送。還有人開發(fā)了一種谷氨酰胺介導(dǎo)的偶聯(lián)方法，利用微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（mTG）將賴氨酸疊氮化物轉(zhuǎn)移到靶抗體上，通過無銅點(diǎn)擊化學(xué)偶聯(lián)含有二苯并環(huán)辛烯（DBCO）的siRNA，寡核苷酸-抗體比率為2。

為了克服天然氨基酸的缺點(diǎn)，另一種位點(diǎn)特異性偶聯(lián)方法是將含有反應(yīng)性基團(tuán)的非天然氨基酸（如疊氮基、乙�；�）引入靶抗體中。例如，在K169和S202，將對(duì)乙酰苯丙氨酸（pAcF）引入曲妥珠單抗的Fab片段中，使其與羥胺修飾的單鏈DNA發(fā)生肟化反應(yīng)，形成AOC，然后用于檢測Her2+細(xì)胞。與天然氨基酸偶聯(lián)相比，非天然氨基酸偶聯(lián)更穩(wěn)定、更有效，然而，抗體工程也相對(duì)繁瑣。此外，這些非天然氨基酸是否會(huì)在人類中引起免疫原性仍不確定。

聚糖偶聯(lián)

由于IgG在Fc區(qū)的CH2或CH3區(qū)的N297處攜帶兩條N-聚糖鏈，遠(yuǎn)離抗原結(jié)合區(qū)，確定連接的有效載荷ON的數(shù)量和位置相對(duì)簡單。例如，具有聚糖轉(zhuǎn)移活性的ENGase突變體（Endo-S，Endo-S2）可以產(chǎn)生具有同質(zhì)聚糖結(jié)構(gòu)的抗體。這種同質(zhì)聚糖結(jié)構(gòu)包含如疊氮化物和生物素的官能團(tuán)，可以實(shí)現(xiàn)高效合成同質(zhì)AOCs，并精確控制藥物抗體比例在2至12之間。

盡管聚糖結(jié)構(gòu)的高度可變性可能對(duì)有效載荷的偶聯(lián)產(chǎn)生挑戰(zhàn)，但糖工程是一種有吸引力的天然抗體功能化生物偶聯(lián)技術(shù)。然而，工程抗體生產(chǎn)過程相對(duì)復(fù)雜，與其他AOC制備過程相比，不能保證高生產(chǎn)率。

肽偶聯(lián)

位點(diǎn)特異性偶聯(lián)可以通過將ON有效載荷偶聯(lián)到抗體末端的短肽標(biāo)簽來實(shí)現(xiàn)，如谷氨酰胺標(biāo)簽（LLQG）、Sortase A識(shí)別基序（LPETG）和SMARTag®（LCxPxR）。

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶能夠在LLQG的谷氨酰胺側(cè)鏈與其伯胺之間形成共價(jià)鍵；分選酶a介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)可以將五甘氨酸修飾的藥物有效載荷轉(zhuǎn)移到LPETG基序上。另一種創(chuàng)新的化學(xué)酶方法是SMARTag®技術(shù)平臺(tái)：利用這項(xiàng)技術(shù)，甲�；�甘氨酸生成酶（FGE）可以將FGE識(shí)別基序（LCxPxR）中的半胱氨酸轉(zhuǎn)化為甲�；�甘氨酸（fGly），抗體就可以通過醛特異性化學(xué)轉(zhuǎn)化進(jìn)行化學(xué)修飾，從而產(chǎn)生均勻穩(wěn)定的偶聯(lián)物。

連接子介導(dǎo)的偶聯(lián)方法

盡管無連接子偶聯(lián)方法比較穩(wěn)健，但它仍然需要對(duì)靶抗體進(jìn)行工程化或修飾，這可能會(huì)影響處理某些類型天然抗體時(shí)的性能。如果可以引入連接分子來交聯(lián)靶抗體和ON有效載荷，而不是簡單地修飾抗體，則可以直接從天然IgG制備精確的AOC，而不需要額外的工程。Fc結(jié)合肽（FcBPs）是用于抗體識(shí)別的最廣泛使用的基序。這些肽能夠特異性識(shí)別IgG的Fc片段。

結(jié)合誘導(dǎo)的交聯(lián)

為了促進(jìn)抗體和寡核苷酸之間的誘導(dǎo)交聯(lián)，已經(jīng)開發(fā)了許多高反應(yīng)性基序，如光交聯(lián)和化學(xué)交聯(lián)試劑，以在FcBP和靶抗體之間形成共價(jià)鍵。幾個(gè)可光活化的基團(tuán)，包括二苯甲酮或馬來酰亞胺苯甲酰亞胺（MBP）、苯甲�；�苯甲酸、對(duì)苯甲�；�苯丙氨酸（BPA）、光亮氨酸（pLeu）和光甲硫氨酸（pMet），已成功地整合到FcBP中。光交聯(lián)的主要優(yōu)點(diǎn)是其高特異性，這是由于激發(fā)的中間體的壽命短。這種方法的缺點(diǎn)是可能生成具有一個(gè)或兩個(gè)標(biāo)簽的異質(zhì)性AOC。

除了光交聯(lián)，化學(xué)交聯(lián)也可以連接氨基以產(chǎn)生共價(jià)AOC，如許多雙功能連接子，包括SMC、DSG和SIAB等。與光交聯(lián)相比，化學(xué)交聯(lián)更容易且具備更好的生物相容性。然而，它的反應(yīng)效率相對(duì)較低，通常需要48?小時(shí)以實(shí)現(xiàn)高度結(jié)合。

結(jié)合誘導(dǎo)的替代

FcBP介導(dǎo)的交聯(lián)方法依賴于FcBP對(duì)抗體的高親和力。然而，引入大的異源FcBP可能會(huì)引起嚴(yán)重的免疫原性，且抗體的性質(zhì)可能會(huì)受到影響。結(jié)合誘導(dǎo)的替代可以通過將官能團(tuán)從FcBP轉(zhuǎn)移到抗體Fc片段中的特定位點(diǎn)（K248、N79等）來解決這個(gè)問題。FcBP用作引導(dǎo)劑，并且可以在抗體-寡核苷酸共價(jià)偶聯(lián)后被替換或釋放。

與無連接子的偶聯(lián)相比，連接子介導(dǎo)的偶聯(lián)可以更好地控制有效載荷的數(shù)量和位點(diǎn)特異性，而無需對(duì)抗體進(jìn)行設(shè)計(jì)。在結(jié)合誘導(dǎo)的交聯(lián)中，F(xiàn)cBP得以保留，使該過程更加簡單有效。另一方面，結(jié)合誘導(dǎo)的替代避免了免疫原性和其他與FcBP相關(guān)的潛在問題，然而需要額外的制備步驟。

小結(jié)

鑒于ADC在臨床上取得的巨大成功，我們堅(jiān)信AOCs作為一種基因治療遞送平臺(tái)具有非常光明的應(yīng)用前景。在此之前，建立強(qiáng)有力的合成方法來產(chǎn)生精確的AOC將為此奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。因此，有必要對(duì)AOC的藥代動(dòng)力學(xué)、免疫原性和療效進(jìn)行全面深入的研究。相信AOCs將在未來十年為臨床應(yīng)用提供光明的未來。

參考文獻(xiàn)：

1.ChemicalBiology Approaches toward Precise Structure Control of IgG-Based Antibody-OligonucleotideConjugates. Chembiochem.2023 May 2;24(9):e202300077

       原文標(biāo)題 : 抗體寡核苷酸偶聯(lián)藥物（AOC）的精確控制偶聯(lián)方法