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文章背景簡介   

BACKGROUND INTRODUCTION

假單胞菌是革蘭氏陰性需氧細(xì)菌，有180多種。假單胞菌廣泛分布于自然界，如土壤、水、食物和空氣中。有莢膜、鞭毛和菌毛。營養(yǎng)要求不高，種類多，與人類感染有關(guān)的主要有銅綠假單胞菌(P. arugino.sa)、類鼻疽假單胞菌(P．pseudomallei)、熒光假單胞菌(P．fluorescens)等。銅綠假單胞菌是常見條件致病菌，特別是醫(yī)院感染；類鼻疽假單胞菌可引起局部地區(qū)（東南亞）人和動物的類鼻疽��；輸入熒光假單胞菌污染血液或血制品，可導(dǎo)致敗血癥或休克。

超過25種假單胞菌與人類和動物的機(jī)會性感染有關(guān)。不過，盡管假單胞菌的一些致病種會引起安全問題，但許多假單胞菌在工業(yè)、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、環(huán)保等領(lǐng)域中也有應(yīng)用價(jià)值。例如，可用于植物病原真菌（如雪霉葉枯菌、鐮刀菌、棉花黃萎病菌、炭疽菌等）及病蟲害的生物防控。還可通過其產(chǎn)生的植物整張激素，發(fā)揮對對植物生長的促進(jìn)作用。在環(huán)境保護(hù)方面，假單胞菌主要可被用于化學(xué)農(nóng)藥的降解、廢水處理、油污處理等。在醫(yī)藥方面的研究也有報(bào)道，例如，研究有從假單胞菌中分離出具有抗腫瘤活性的大環(huán)類酯類化合物OximidinesI 和II，并有利用假單胞菌外毒素與單克隆抗體結(jié)合抗腫瘤的報(bào)道。

近些年來，CRISPR/Cas系統(tǒng)作為基因編輯工具，已經(jīng)廣受關(guān)注。但事實(shí)上，CRISPR/Cas系統(tǒng)本身是原核生物的一種獲得性免疫系統(tǒng)，用于抵抗存在于噬菌體或質(zhì)粒的外源遺傳元件的入侵。CRISPR/Cas系統(tǒng)是存在于大多數(shù)細(xì)菌與所有的古菌中的一種防御機(jī)制，以消滅外來的質(zhì)體或者噬菌體的DNA。CRISPR序列是由可以感染原核生物的噬菌體DNA片段衍生來的。它可以檢測并摧毀能引起相似感染的其他噬菌體中相似的DNA，因此對原核生物抗噬菌體至關(guān)重要。它是由富含AT-的前導(dǎo)序列與跟隨其后的，被短重復(fù)序列隔開的特殊間隔序列（spacer）所組成。這些短序重復(fù)序列一般由28-37個(gè)堿基對組成（總范圍23-55堿基對）。而spacer一般由32-38堿基對組成（21-72bp）。新的spacer可以在免疫系統(tǒng)被新的噬菌體感染后出現(xiàn)，但是一般整個(gè)基因中只有少于50組的重復(fù)序列-spacer序列。CAS則是一種核酸內(nèi)切酶�？梢岳�用CRISPR序列中間隔序列（spacer）對應(yīng)的RNA指引，識別并且切割特定與其序列互補(bǔ)的DNA鏈。

近年來，人們逐漸發(fā)現(xiàn)，假單胞菌的致病性、對物理化學(xué)條件的耐受性，甚至微生物代謝和生物循環(huán)等方面，與其CRISPR-Cas系統(tǒng)也有密切的相關(guān)性。研究表明，CRISPR-Cas系統(tǒng)調(diào)節(jié)假單胞菌的生物膜生成和聚集行為。

在假單胞菌屬基因組中尋找CRISPR結(jié)構(gòu)具有重要意義，因?yàn)樗�有助于研究這些遺傳元件在各種環(huán)境中的多樣性和分布。

2023年6月，蘇利亞大學(xué)Ángel Parra-Sánchez等人在《Genes》（SCI基因與遺傳學(xué)分區(qū)2區(qū)，IF=3.5）上發(fā)表了題為“Comparative Analysis of CRISPR-Cas Systems in Pseudomonas Genomes”的文章，分析了不同環(huán)境下假單胞菌基因組中CRISPR-Cas系統(tǒng)的存在。 

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所用到的主要方法

METHODS   

1、 CRISPR結(jié)構(gòu)的鑒定

2、CRISPR相關(guān)基因(CAS)和CAS蛋白的鑒定與比較

3、間隔序列起源和多樣性的確定

4、原間隔物鄰近基序(PAMs)與自靶向的鑒定

5、直接重復(fù)序列(DR序列)保守性的測定和RNA二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測

6、統(tǒng)計(jì)分析

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文章主要內(nèi)容摘要

ABSTRACT 

假單胞菌中有一些是來自陸地的腐生菌，另一些與人類和動物的機(jī)會性感染有關(guān)。其致病性或代謝方面的因素與CRISPR-Cas有關(guān)，對其進(jìn)行的計(jì)算機(jī)研究更多地集中在臨床和非環(huán)境設(shè)置上。

這項(xiàng)研究旨在對假單胞菌基因組中存在的CRISPR-Cas系統(tǒng)進(jìn)行計(jì)算機(jī)分析。研究分析了NCBI數(shù)據(jù)庫中275個(gè)假單胞菌的完整基因組序列。從CRISPRdb獲得了CRISPR基因座。利用BLAST對與CRISPR (cas)和cas蛋白相關(guān)的基因、間隔序列的起源和多樣性進(jìn)行了鑒定和比較。利用WebLogo 3.6對自靶向序列、PAM和DR序列的守恒性進(jìn)行了可視化分析。使用RNAFold和MFold分析了CRISPR-like RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。結(jié)果顯示：在19.6%的假單胞菌中鑒定出了CRISPR結(jié)構(gòu)�？偣舶l(fā)現(xiàn)了113個(gè)典型的CRISPR序列，其中有18個(gè)推測的Cas基因，還有2050個(gè)間隔序列，其中52%與噬菌體同源，26%與染色體同源，22%與質(zhì)粒同源。在CRISPR陣列中未檢測到潛在的自靶向。所有發(fā)現(xiàn)的DR序列都能形成熱力學(xué)穩(wěn)定的二級RNA結(jié)構(gòu)。本研究對CRISPR/Cas系統(tǒng)的比較有助于了解臨床和環(huán)境相關(guān)物種各進(jìn)化譜系的環(huán)境適應(yīng)性，為非常規(guī)CRISPR的細(xì)菌分型、可追溯性、分析和探索提供了數(shù)據(jù)支持。

簡而言之，本文的主要研究內(nèi)容有：

1、 分析假單胞菌CRISPR基因座。

2、檢測假單胞菌CRISPR陣列是否有自靶向。

3、分析DR序列是否形成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)以及形成二級結(jié)構(gòu)的熱力學(xué)參數(shù)的計(jì)算。

       原文標(biāo)題 : 假單胞菌基因組CRISPR-Cas系統(tǒng)的比較分析