駱駝瘤胃中堿性耐熱木聚糖酶的挖掘及在木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用
文章背景簡(jiǎn)介
植物木質(zhì)纖維素生物質(zhì)是可持續(xù)發(fā)展的重要原料,可以應(yīng)用于生產(chǎn)動(dòng)物飼料、生物能源等多種工業(yè)產(chǎn)品。其中農(nóng)業(yè)殘留物以及能源作物是最有希望的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)來源之一。然而目前所面臨的主要的挑戰(zhàn)在于植物細(xì)胞壁與生俱來的剛性和緊湊結(jié)構(gòu)對(duì)生物降解具有極大的阻礙,這是有效利用許多農(nóng)業(yè)廢物的一個(gè)主要障礙。每年都有大量沒有被家畜消化的農(nóng)業(yè)殘留物只能被通過焚燒或銷毀處理。而木聚糖酶作為一種水解酶,可以隨機(jī)分裂復(fù)雜植物細(xì)胞壁多糖木聚糖,通過酶預(yù)處理破壞植物細(xì)胞壁,可釋放木質(zhì)素和半纖維素成分、促進(jìn)消化降解過程。為了滿足行業(yè)需求,理想的木聚糖酶應(yīng)具有較高的比活性、良好的PH值和熱穩(wěn)定性。由于駱駝的飲食結(jié)構(gòu)主要由木質(zhì)灌木和樹木生物群落、各種鹽生植物和芳香植物物種組成,因此駱駝瘤胃微生物群落應(yīng)具有降解這些富含木質(zhì)纖維素和抗?fàn)I養(yǎng)因子難降解物質(zhì)的能力,從而被視為新型高效木聚糖酶的重要潛在來源。
2019年,伊朗農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所的Shohreh Ariaeenejad等人,在《Bioresource Technology》雜志(IF2017=5.807;生物工程與應(yīng)用微生物2區(qū))發(fā)表了題為“Mining of camel rumen metagenome to identify novel alkali-thermostable xylanase capable of enhancing the recalcitrant lignocellulosic biomass conversion”的文章。
所用到的主要方法
1.五階段計(jì)算篩選法:在尋找合適的侯選酶時(shí),往往只通過生物方法是很難找尋到的。因此執(zhí)行了五個(gè)互補(bǔ)計(jì)算階段,來快速找尋侯選酶。主要步驟為階段一:將從元基因組中提取的酶列表與我們選定包含實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的酶列表進(jìn)行比對(duì);階段二:研究候選序列在已知序列中的系統(tǒng)發(fā)育為止,剔除遠(yuǎn)親;階段三對(duì)前一階段剩余酶進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè);階段四:研究前一階段剩余序列所選酶的三級(jí)結(jié)構(gòu);階段五:使用Expasy PROSITE軟件對(duì)剩余候選序列進(jìn)行活性位點(diǎn)分析。除PROSITE軟件外,主要涉及的軟件有應(yīng)用FASTQC對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)和驗(yàn)證。使用meta-velvet assembler從原始測(cè)序片段構(gòu)建contigs,以及使用MetaGeneMark軟件預(yù)測(cè)木聚糖酶基因。
2.PCR
3.SDS-PAGE
4.Bradford法測(cè)定蛋白濃度
5.DNS法測(cè)酶活
6.TLC薄層色譜法
7.AFM(原子力顯微鏡)分析:其原理為當(dāng)原子間距離減小到一定程度以后,原子間的作用力將迅速上升;因此,由顯微探針受力的大小就可以直接換算出樣品表面的高度,從而獲得樣品表面形貌的信息。AFM可以在大氣和液體環(huán)境下對(duì)各種材料和樣品進(jìn)行納米區(qū)域的物理性質(zhì)包括形貌進(jìn)行探測(cè),或者直接進(jìn)行納米操縱;現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于半導(dǎo)體、納米功能材料、生物、化工、食品、醫(yī)藥研究和科研院所各種納米相關(guān)學(xué)科的研究實(shí)驗(yàn)等領(lǐng)域中,成為納米科學(xué)研究的基本工具。在觀測(cè)酶活生理過程中AFM是有力工具,同時(shí)還為酶活測(cè)定開辟了新思路,是傳統(tǒng)酶活測(cè)定方法的有力補(bǔ)充。
文章主要內(nèi)容摘要
農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和相關(guān)產(chǎn)業(yè)所產(chǎn)生的廢棄物中含有豐富的木聚糖和木素。除了不利的環(huán)境后果外,也將造成寶貴資源的浪費(fèi)。為了防止這些頑固不化的廢棄物造成生態(tài)失衡,并將其回收再利用,探索高效降解酶是一項(xiàng)嚴(yán)峻的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)需求。特別是能在極端溫度和pH條件下發(fā)揮活性的木聚糖酶?jìng)涫苋藗兊年P(guān)注,其中耐熱耐堿性木聚糖酶將有助于降低冷卻成本、提高反應(yīng)速度、延長(zhǎng)酶的半衰期、降低微生物污染和噬菌體感染的可能性,從而提高木質(zhì)纖維素基質(zhì)的溶解度和工業(yè)過程的催化效率,提高揮發(fā)性產(chǎn)品的回收率。這類木聚糖酶是回收大量木聚糖和殘留的半纖維素廢物的關(guān)鍵因素。與其他研究環(huán)境相比,駱駝瘤胃微生物環(huán)境的一個(gè)顯著特征是瘤胃中纖維細(xì)菌種類相對(duì)豐富,它們的豐富可能與駱駝的高木質(zhì)纖維素飲食有關(guān)。這些獨(dú)特的特性使駱駝瘤胃成為開發(fā)這種新型酶的合適候選。而由于駱駝瘤胃微生物群中蘊(yùn)含的酶資源十分豐富,僅通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法就想要找到具有理想性質(zhì)的酶無異于大海撈針。該研究通過計(jì)算篩選鑒定了一種堿性耐熱木聚糖酶。除了基因預(yù)測(cè)和注釋步驟外,考慮blast結(jié)果、系統(tǒng)發(fā)育位置、預(yù)測(cè)的三級(jí)結(jié)構(gòu)、氨基酸組成,并對(duì)其活性位點(diǎn)進(jìn)行分析,提出了一個(gè)五階段的步驟。經(jīng)鑒定、克隆純化、生物物理實(shí)驗(yàn),最終證實(shí)該酶具有較強(qiáng)的堿熱穩(wěn)定性,并成功地應(yīng)用于木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的生物漂白和糖化。
木聚糖雙芽孢桿菌糖苷水解酶AxMan113A的結(jié)構(gòu)解析
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