01

文章背景簡(jiǎn)介

BACKGROUND INTRODUCTION

修復(fù)雙鏈斷裂（DSB）的機(jī)制一般有兩種，一種涉及重組以精確地恢復(fù)斷裂區(qū)域中的遺傳信息，另一種是易錯(cuò)的末端連接，可能與斷裂末端之間的微同源性關(guān)聯(lián)。末端切除通常被認(rèn)為是在兩種修復(fù)機(jī)制之間選擇的關(guān)鍵決定因素。雖然切除通常被認(rèn)為在DSB重組修復(fù)中起關(guān)鍵作用，但目前還沒(méi)有直接評(píng)估“臟”DSB（例如輻射誘導(dǎo)的DSB）的切除量與修復(fù)效率之間關(guān)系的研究。在“干凈”的DSB（例如通過(guò)HO內(nèi)切酶或I－SceI內(nèi)切酶誘導(dǎo)發(fā)生的DSB）處切除被描述為是兩步過(guò)程：其中MRX（萌芽酵母中的Mre11 ／ Rad50 ／ Xrs2；哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的MRN）和Sae2（CtIP）的作用僅限于最初的短切除步驟（＜50–100個(gè)堿基），然后由Exo1和／或Sgs1 ／ Dna2的組合進(jìn)行廣泛切除，可跨越數(shù)千個(gè)堿基。在沒(méi)有MRX或Sae2的情況下，Exo1或Sgs1 ／ Dna2可以啟動(dòng)切除——盡管這一作用的效率較為低下。

電離輻射（IR）是DSB的常見(jiàn)來(lái)源，也是癌癥治療中使用的最常見(jiàn)的試劑之一。IR－DSB的切除速率約為每小時(shí)1－2kb，并且基于恢復(fù)染色體數(shù)量的增加，基因組中近50％的IR－DSB在半小時(shí)內(nèi)修復(fù)。

美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院James W． Westmoreland等人2019年在《Nucleic Acids Research》（IF 11．147，生物1區(qū)）發(fā)表了題為“Recombinational repair of radiation－induced double－strand breaks occurs in the absence of extensive resection”的研究。研究了在沒(méi)有大范圍切除的情況下輻射誘導(dǎo)的雙鏈斷裂發(fā)生重組修復(fù)。

02

所用到的主要方法

METHODS

1．脈沖電泳實(shí)驗(yàn)

2．southernblot轉(zhuǎn)移雜交

3．DSB的量化

03

文章主要內(nèi)容摘要

ABSTRACT

重組修復(fù)在雙鏈斷裂（DSB）誘導(dǎo)后提供精確的染色體修復(fù)。雖然所有DSB重組修復(fù)模型都包括5－3切除，但目前還沒(méi)有研究直接用于輻射（IR）誘導(dǎo)的“臟”DSB隨機(jī)細(xì)胞中G－2期姐妹染色單體修復(fù)所需的切除。本研究使用脈沖場(chǎng)凝膠電泳移位方法確定了WT和EXO1核酸外切酶或Sgs1解旋酶的突變體在IR－DSB處的切除。缺少二者任何一個(gè)會(huì)使得切除長(zhǎng)度減少一半，但并沒(méi)有減少DSB修復(fù)水平或細(xì)胞存活率。在Exo1Δsgs1Δ雙突變體中，幾乎檢測(cè)不到切除，但只需要額外的一個(gè)小時(shí)就能達(dá)到與WT相當(dāng)?shù)男迯?fù)水平，并且對(duì)細(xì)胞生存率只有2成的劑量有調(diào)節(jié)效果Dnl4缺失菌株的結(jié)果表明，剩余的修復(fù)不是由于末端連接。因此，與單個(gè)干凈的HO誘導(dǎo)的DSB相似，切除長(zhǎng)度的嚴(yán)重縮短對(duì)G2阻滯細(xì)胞中多個(gè)“臟”的DSB的再配對(duì)僅產(chǎn)生輕微的影響。值得注意的是，這項(xiàng)研究首次將DSB的切除長(zhǎng)度與姐妹染色單體之間的全局重組修復(fù)能力直接聯(lián)系起來(lái)。

本研究首次演示了IR－DSB誘導(dǎo)姐妹染色單體之間的分子重組體，這通過(guò)線性二聚體分子的產(chǎn)生來(lái)證明，這也包括重組體可能是如何形成的描述。實(shí)驗(yàn)表明在DSB的兩端有一致的切除起始，這是由于末端之間的切除的協(xié)調(diào)。MRX已被證明在確定的DSB處開(kāi)始切除，隨后通過(guò)Exo1或Sgs1／DNA2進(jìn)一步廣泛切除。核酸酶的丟失減少了單個(gè)“干凈”DSB的切除，導(dǎo)致通過(guò)單鏈退火減少了對(duì)放置在直接重復(fù)之間的單個(gè)“干凈”DSB的修復(fù)。本文研究表明缺少Exo1或Sgs1／DNA2會(huì)導(dǎo)致IR－DSB的切除率降低一半，而對(duì)DSB修復(fù)幾乎沒(méi)有影響。Exo1和Sgs1／DNA2的聯(lián)合丟失導(dǎo)致幾乎檢測(cè)不到的IR－DSB切除水平。盡管如此，DSB的修復(fù)或存活率只有相對(duì)較小的降低，這表明在對(duì)照組細(xì)胞中的切除比修復(fù)或產(chǎn)生重組二聚體分子所需的切除要多得多。重要的是，本研究證明了低切除修復(fù)是由于重組而不是末端連接。這些結(jié)果得出了一個(gè)耐人尋味的可能性，酵母和脊椎動(dòng)物中DSB的重組修復(fù)可能在機(jī)制上比以前認(rèn)識(shí)到的更相似。