前言

腫瘤免疫治療已成為第三代腫瘤治療中最活躍的研究領(lǐng)域。過去的治療方法，如化療或放療，大多以直接殺傷腫瘤細(xì)胞為目的。由于缺乏特異性，這些療法經(jīng)常會對免疫細(xì)胞產(chǎn)生副作用，導(dǎo)致患者免疫狀態(tài)的減弱。腫瘤靶向治療的發(fā)展是向個性化醫(yī)學(xué)方向邁進的一大步，它提高了針對腫瘤的特異性，限制了一些副作用。相比之下，過去幾十年的許多臨床研究表明，靶向腫瘤微環(huán)境（TME）并刺激抗腫瘤免疫反應(yīng)可產(chǎn)生強健而持久的抗腫瘤作用。這導(dǎo)致了以PD－1、CTLA－4和PD－L1為靶點的免疫檢查點抑制（ICI）療法的監(jiān)管批準(zhǔn)，并且該列表可能會隨著新的免疫檢查點的開發(fā)（如TIM－3、LAG－3和TIGIT）而繼續(xù)擴大。ICI治療的主要目的是維持先前建立的抗腫瘤活性。相比之下，刺激性免疫治療靶點，如CD40、ICOS、CD27、GITR、OX40和4－1BB則用激動劑來激活免疫，主要集中在免疫反應(yīng)的早期階段。這些分子最先起作用的很可能是CD40，因為它在抗原呈遞過程中起著關(guān)鍵作用，間接地激活T細(xì)胞。

CD40／CD40L的表達

為了獲得強大而特異的免疫反應(yīng)，固有免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)需要在多個環(huán)節(jié)上進行協(xié)調(diào)。免疫反應(yīng)的許多關(guān)鍵階段是由腫瘤壞死因子超家族（TNFSF）的配體及其受體介導(dǎo)的，包括CD40／CD40L。抗原特異性T細(xì)胞的有效抗原識別關(guān)鍵取決于特異性抗原呈遞細(xì)胞（APC）的存在和功能，如B細(xì)胞和DC細(xì)胞。這些APC通常在細(xì)胞表面表達共刺激表面受體CD40（TNFRSF5）。

CD40是一種48kda大小的Ⅰ型跨膜蛋白，是連接固有免疫和適應(yīng)性免疫的重要免疫細(xì)胞通訊介質(zhì)。CD40存在于血小板、B細(xì)胞和髓系細(xì)胞，但也存在于非造血細(xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞甚至某些類型的腫瘤細(xì)胞。CD40的同源配體是CD154（TNFSF5／CD40L），一種39kda的II型跨膜蛋白。CD40L的表達通常可誘導(dǎo)并局限于造血系統(tǒng)的細(xì)胞，如血小板、粒細(xì)胞、活化T細(xì)胞、活化B細(xì)胞和活化自然殺傷細(xì)胞（NK）細(xì)胞，但內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞也有弱表達。

CD40／CD40L的生物學(xué)相關(guān)性

CD40在單核細(xì)胞及其子代巨噬細(xì)胞和DC細(xì)胞以及B細(xì)胞上的表達在發(fā)揮免疫細(xì)胞的功能中起著重要作用。單核細(xì)胞是固有免疫前體細(xì)胞，具有很高的可塑性。它們具有分化為多種細(xì)胞類型的能力，如巨噬細(xì)胞、髓源性抑制細(xì)胞（MDSC）和DC細(xì)胞。CD40信號是單核細(xì)胞成熟過程的重要觸發(fā)因素，主要驅(qū)動分化為M1譜系的巨噬細(xì)胞和DC細(xì)胞。CD40與DC細(xì)胞表面的結(jié)合促進了細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，誘導(dǎo)共刺激分子的表達，并促進抗原的交叉呈遞。CD40L的主要功能之一是通過激活DC細(xì)胞來增強抗原對T細(xì)胞的提呈。這一步稱為“許可”，通過上調(diào)表面蛋白如CD54和CD86，增加DC與T細(xì)胞的相互作用，從而激活后者。

B細(xì)胞也是CD40L活性的靶點。在胸腺中，T細(xì)胞和B細(xì)胞之間廣泛的串?dāng)_使之必須維持表達CD40的B細(xì)胞，從而保持自體反應(yīng)性T細(xì)胞對B細(xì)胞的陰性選擇。B細(xì)胞與CD4＋T細(xì)胞的直接相互作用誘導(dǎo)T細(xì)胞表達CD40L，進而保護B細(xì)胞不受凋亡的影響。在這個功能中，CD40L通過激活PI3K／Akt提供一個生存信號，使活化的B細(xì)胞維持壽命并向漿細(xì)胞分化�？乖�特異性B細(xì)胞通過CD40的穩(wěn)態(tài)增殖和生存機制是通過抗凋亡成員Bcl－2家族的上調(diào)來維持的。事實上，CD40／CD40L系統(tǒng)的缺陷與B細(xì)胞的抗體類別轉(zhuǎn)換以及細(xì)胞超突變的缺陷（hyper－IgM綜合征）有關(guān)。

B細(xì)胞與活化的表達CD40L的T細(xì)胞的相互作用也增加了MHC－II和CD80或CD86等共刺激分子的表達，并誘導(dǎo)B細(xì)胞中的Ig類別轉(zhuǎn)換�；罨�的B細(xì)胞遷移到淋巴器官，在那里向T細(xì)胞呈遞抗原，CD40激活的DC和B細(xì)胞通過釋放免疫刺激性細(xì)胞因子和趨化因子如IL－6、IL－12p70、IFNγ、CXCL10和TNFα來支持免疫應(yīng)答。此外，CD40活化的B細(xì)胞能夠通過促進TNFα和IFNγ等細(xì)胞因子的分泌來誘導(dǎo)抗原特異性CD8＋T細(xì)胞。一些研究證明，體外活化的表達CD40的B細(xì)胞是完全功能性抗原提呈的B細(xì)胞，隨后用這些細(xì)胞進行過繼細(xì)胞轉(zhuǎn)移（ACT）治療可提高抗腫瘤的療效。

CD40／CD40L與腫瘤免疫治療的相關(guān)性

數(shù)十年來，CD40／CD40L信號傳導(dǎo)同步免疫反應(yīng)的固有、細(xì)胞和體液分支的非凡能力激發(fā)了基礎(chǔ)和臨床研究的靈感。鑒于CD40的一般表達譜和生物學(xué)活性，人們已經(jīng)做了許多嘗試來探索CD40／CD40L信號在抗腫瘤免疫中的作用。

CD40激活的DC細(xì)胞可用于癌癥和傳染性疾�。ㄈ缃Y(jié)核病）的疫苗治療。CD40信號的另一個有趣結(jié)果是表型從“另類活化”的M2型向抗腫瘤或“經(jīng)典活化”的M1型的轉(zhuǎn)變。這種M1／M2型的命名與腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）在腫瘤免疫治療中特別相關(guān)。所謂的M1型的“經(jīng)典活化”巨噬細(xì)胞產(chǎn)生于對GM－CSF以及IFNγ和LPS等刺激物的反應(yīng)，通常被認(rèn)為具有促炎性免疫反應(yīng)和抗原交叉呈遞的作用。M1型巨噬細(xì)胞主要與良好的抗腫瘤免疫反應(yīng)相關(guān)�！傲眍惢罨�”的M2型巨噬細(xì)胞是由于暴露于M－CSF和細(xì)胞因子（如IL－4和IL－10）而產(chǎn)生的，并參與組織修復(fù)和消除炎癥狀態(tài)。腫瘤相關(guān)的M2型被認(rèn)為是癌癥進展和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵驅(qū)動因素。腫瘤和浸潤性巨噬細(xì)胞的緊密相互作用強烈地塑造了腫瘤微環(huán)境，從而建立了炎癥或促腫瘤的局部條件。有人提出，改善腫瘤內(nèi)M2／M1譜系的平衡可以通過促進細(xì)胞毒性T細(xì)胞的浸潤和激活來提高抗腫瘤免疫反應(yīng)。這一點已經(jīng)在多個模型中進行了描述，例如胰腺癌和小鼠異種移植膠質(zhì)母細(xì)胞瘤模型。巨噬細(xì)胞復(fù)極化與CD40活化誘導(dǎo)CD206下調(diào)和CD54表達增加一致，表明巨噬細(xì)胞遷移能力的改變和有效激活。

有趣的是，盡管CD40在許多組織中廣泛表達，腫瘤細(xì)胞似乎更易受膜結(jié)合CD40L誘導(dǎo)的CD40殺傷。在B16黑色素瘤小鼠模型中，DC細(xì)胞上表達的膜結(jié)合CD40L可直接誘導(dǎo)CD40陽性腫瘤細(xì)胞凋亡，而非T細(xì)胞依賴的的細(xì)胞生長抑制活性則源于CD40刺激的IFNγ激活的巨噬細(xì)胞。這一現(xiàn)象的部分原因可能不是CD40信號的直接作用，而是對易感細(xì)胞類型死亡受體的二次上調(diào)。然而，抗CD40抗體Lucatumumab和dacetuzumab對B細(xì)胞惡性腫瘤有一定的臨床效果，這可能歸因于抗體介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞吞噬和抗體依賴性細(xì)胞毒性（ADCC）的作用。連接CD40后，腫瘤細(xì)胞顯示出DNA損傷的跡象，分泌促血管生成因子，如VEGF和IL－8，并且通常表現(xiàn)出衰老相關(guān)分泌表型（SASP）的狀態(tài)，這是由于CD40誘導(dǎo)的NFκB通路的激活。

CD40／CD40L的結(jié)構(gòu)、組成及信號通路

TNF－R－SF信號傳導(dǎo)的結(jié)構(gòu)已經(jīng)比較明確，需要恰當(dāng)?shù)娜�維受體聚集和三聚體化。雖然TNF－SF配體天然以三價功能單位存在，但受體通常分散分布在細(xì)胞表面。TNF－SF配體以同源三聚體的形式自然地聚集在細(xì)胞表面，其中三個受體結(jié)合位點位于相鄰單體之間的三個完全相同的縫隙處。關(guān)鍵的是，受體組裝成功能性的三聚體復(fù)合物是通過天然配體單元的結(jié)合發(fā)生的。這些三聚體TNF－SF配體與在其他細(xì)胞表面表達的相應(yīng)受體的相互作用導(dǎo)致了非常精確的受體聚集。配體對細(xì)胞外受體的指令傳遞給鄰近的受體細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，然后是細(xì)胞內(nèi)信號復(fù)合物的有序組裝。TNF－SF配體的三聚體結(jié)構(gòu)和由此產(chǎn)生的受體簇是信號傳遞到細(xì)胞的前提。由于這種特殊的要求，一價和二價的結(jié)構(gòu)在體內(nèi)通常被證明是極低效的。

與TNF－R－SF的其他成員一樣，CD40是一種膜結(jié)合分子，可以通過細(xì)胞間直接接觸被膜結(jié)合配體激活，也可以被溶液中的可溶性配體激活。多種下游分子和細(xì)胞反應(yīng)進程已被證明受到CD40結(jié)合的調(diào)節(jié)。同源配體連接受體可誘導(dǎo)形成空間上明確的三聚體信號復(fù)合物，促進TNF受體相關(guān)因子（TRAFs）和NFκB激活劑－1（Act1）的招募。信號復(fù)合物的特定組成，主要取決于細(xì)胞類型，觸發(fā)各種途徑。例如，與TRAF6的結(jié)合主要激活JAK／Stat3通路，TRAF1／2誘導(dǎo)MKK／p38／ERK1／2信號傳導(dǎo)，Act1在NFkB通路、JNK和PI3K信號傳導(dǎo)中具有多種功能，并與TRAF3一起放大MKK／p38／ERK1／2信號。此外，根據(jù)特定的環(huán)境，CD40結(jié)合可以激活“經(jīng)典”和非典型的NFkB通路。

CD40激動劑的開發(fā)

基于其獨特的受體聚集模式，從TNF－R－SF產(chǎn)生的下游信號依賴于具有非常精確的結(jié)構(gòu)和三維組成的激動劑化合物。由于CD40在抗腫瘤免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，誘導(dǎo)CD40信號的各種策略已經(jīng)被廣泛地研究探索。大致可分為基于激動劑抗體的方法或基于CD40L的方法。后者可進一步分為使用CD40L類似物的重組蛋白方法和將CD40L基因?qū)�入靶�?xì)胞的基因治療方法。第一個CD40靶向的臨床試驗始于20多年前。這些初步試驗測試了重組CD40L和過度表達CD40L的細(xì)胞疫苗。第一個激動劑抗體試驗，使用CP－870893和SGN－40，大約在五年后開始。這些早期臨床試驗顯示了一些令人鼓舞的結(jié)果；目前，有7種抗體和4種基于CD40L的方法正在進行臨床試驗中。

抗體：抗體最重要的特征是其同源表位的高度特異性。抗體可以特異性地結(jié)合到給定蛋白質(zhì)上的多個獨特的表位，包括線性表位和構(gòu)象表位。重要的是，表位的位置在活性中起著至關(guān)重要的作用。這最初是通過顯示具有不同表位的抗體在結(jié)合后產(chǎn)生不同的CD40信號級聯(lián)來證明的。其中抗人CD40抗體的刺激活性隨著表位變得更接近細(xì)胞膜而降低。

有趣的是，人們推測表位位置的重要性實際上與Fc域的可及性有關(guān)。具體地說，當(dāng)抗體的Fc結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞表面的遠(yuǎn)端結(jié)合時，F(xiàn)cγ受體（FcγR）可接近，但與膜結(jié)合較近的抗體的Fc結(jié)構(gòu)域?qū)�無法最佳地與FcγR結(jié)合。這突出了抗原結(jié)合位點和Fc結(jié)構(gòu)域在活性中發(fā)揮作用的重要性。由于其雙價性質(zhì)，除非交聯(lián)，否則抗CD40抗體不會提供顯著療效所需的聚集能力。事實上，治療性抗體，尤其是抗CD40抗體，通常依賴于通過Fcγ受體（FcγR）的二次交聯(lián)來獲得生物活性。這些Fc／FcR相互作用產(chǎn)生其他的反應(yīng)。例如，F(xiàn)c區(qū)域介導(dǎo)靶細(xì)胞的CDC或ADCC作用。事實上，ADCC是抗CD40抗體Lucatumab在治療慢性淋巴細(xì)胞性淋巴瘤以及其他用于癌癥治療的抗體，如曲妥珠單抗（anti－HER2）、利妥昔單抗（rituximab，抗CD20）和伐利侖單抗（Varliumab，anti－CD27）活性的根本原因。這意味著抗體的兩端在發(fā)揮生物學(xué)功能時都具有重要的作用。就抗CD40抗體而言，這也意味著它們具有混合的作用模式。當(dāng)討論抗CD40抗體的治療指標(biāo)，比較療效和安全性時，這一點變得尤為重要。

早期抗CD40抗體缺乏顯著的臨床活性促使人們對其進行了許多改進。目前，七種獨特的抗CD40抗體正在進行臨床試驗，包括CP－870893，并且最近發(fā)表了一些新的結(jié)果，這些新的研究集中在新的表位、新的Fc區(qū)域設(shè)計，以及聯(lián)合治療，以改善以往觀察到的有限的臨床療效。

基于CD40L的細(xì)胞和基因治療：最早的CD40靶向方法涉及在不同細(xì)胞群中構(gòu)建CD40L的過度表達。目前，可進一步分為兩種主要方法：表達CD40L的細(xì)胞疫苗和使用溶瘤病毒等載體系統(tǒng)的CD40L特異性基因治療。另外，由于樹突狀細(xì)胞是CD40L和抗原交叉呈遞的主要靶細(xì)胞之一，提高這種細(xì)胞類型的療效和敏感性的一種方法是用CD40轉(zhuǎn)導(dǎo)并隨后作為改進的疫苗載體使用。一種體內(nèi)激活誘導(dǎo)性CD40的自體樹突狀細(xì)胞疫苗已經(jīng)用于晚期前列腺癌的臨床試驗。

之前使用這些方法的臨床試驗表現(xiàn)出有限的臨床活性。最近的一些進展，包括正在進行的臨床試驗和發(fā)表的文章，已經(jīng)證明了這些方法的潛力。例如，在臨床前模型中，表達CD40L的嵌合抗原受體（CAR）T細(xì)胞顯示出增強的抗腫瘤活性。這種方法結(jié)合了CAR－T細(xì)胞靶向的特異性和基于CD40L的共刺激，使其成為“細(xì)胞雙特異性”。顯然，研究結(jié)果表明，細(xì)胞疫苗并不是唯一一種可以從靶向CD40中獲益的過繼細(xì)胞療法（ACT）。CD40L的遞送方式和模式的進一步發(fā)展也顯示出了一些前景。

基于CD40L的重組蛋白（天然配體類似物）：最后一種方法是直接注射可溶性重組CD40L，這些蛋白是內(nèi)源性CD40L的分子類似物，通過受體結(jié)合域與CD40特異性地相互作用。這已經(jīng)通過使用純化的CD40L、穩(wěn)定的三價／三聚體形式和最近的六價／六聚體形式的CD40L來實現(xiàn)。如前所述，CD40需要正確地三聚體以傳遞有效的信號。雖然純化的CD40L在溶液中容易三聚，但CD40L的方法并不是很成功。然而，穩(wěn)定的三聚體形式，如異亮氨酸拉鏈CD40L形式，在與IL－6阻斷劑結(jié)合時表現(xiàn)出一些活性。