前言

blinatumomab在治療復(fù)發(fā)或難治性急性淋巴細(xì)胞白血病方面的成功，使基于雙特異性抗體的T細(xì)胞導(dǎo)向療法成為腫瘤免疫治療藥物開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)。

這種分子結(jié)構(gòu)是通過(guò)與T細(xì)胞上的CD3和癌細(xì)胞上的腫瘤相關(guān)抗原（TAA）的相互作用來(lái)連接T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。通過(guò)繞過(guò)MHC／TCR識(shí)別，這種方法能夠在沒(méi)有克隆限制的情況下誘導(dǎo)T細(xì)胞活化，并克服因?yàn)镸HC表達(dá)下調(diào)產(chǎn)生的腫瘤免疫逃逸。

近年來(lái)，隨著雙抗表達(dá)和純化技術(shù)的不斷突破，雙抗已經(jīng)發(fā)展出近70種結(jié)構(gòu)，而不同的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不同的抗原識(shí)別臂距離。鑒于幾何構(gòu)型可能在形成免疫突觸中起關(guān)鍵作用，通過(guò)構(gòu)建兩種不同形式的雙特異性抗體模式：diabody FC（DbFc）和基于IgG的分子模式，研究發(fā)現(xiàn)擁有更長(zhǎng)結(jié)合臂的IgG分子結(jié)構(gòu)對(duì)膜近端的抗原表位更有效，而擁有較短結(jié)合臂的DbFc對(duì)對(duì)膜遠(yuǎn)端的抗原表位更有效。

雙抗形式取決于作用目的

隨著重組蛋白表達(dá)技術(shù)和抗體工程技術(shù)的發(fā)展，產(chǎn)生了許多不同的抗體形式。最佳的抗體結(jié)構(gòu)取決于所期望的生物效應(yīng)及其潛在的結(jié)構(gòu)條件。多特異性抗體用于各種目的，包括受體激活、阻斷、內(nèi)化、聚集、膜相關(guān)蛋白的結(jié)合或細(xì)胞毒性效應(yīng)細(xì)胞的定向靶點(diǎn)。

人工免疫突觸的結(jié)構(gòu)特征

抗原呈遞細(xì)胞（APC）與T細(xì)胞之間的生理免疫突觸（IS）是T細(xì)胞活化的關(guān)鍵。在T細(xì)胞膜上，IS顯示為一個(gè)嵌套的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，常被稱為“bullseye”。中心區(qū)cSMAC（中央超分子激活簇）包含諸如T細(xì)胞受體（TCR）復(fù)合物、共刺激分子CD28、抑制免疫檢查點(diǎn)（如PD－1或CTLA－4）、信號(hào)介質(zhì)如Lck（淋巴細(xì)胞特異性蛋白酪氨酸激酶）和PKC（蛋白激酶C），以及穿孔素等細(xì)胞毒性分子。

cSMAC被周?chē)�的SMAC（pSMAC）包圍，其中包含許多粘附分子，它們介導(dǎo)細(xì)胞－細(xì)胞的結(jié)合（如LFA1）。遠(yuǎn)端環(huán)（dSMAC）包括抑制性酪氨酸磷酸酶CD45和動(dòng)態(tài)肌動(dòng)蛋白。APC和T細(xì)胞之間的膜距離約為13–15nm。試驗(yàn)表明，一個(gè)拉長(zhǎng)的膜間距降低了T細(xì)胞的活化，說(shuō)明較近的距離是必須的，以適當(dāng)?shù)卣T導(dǎo)T細(xì)胞活化。眾所周知，BsAb通過(guò)同時(shí)結(jié)合靶細(xì)胞上的TCR亞單位CD3ε和TAA來(lái)促進(jìn)規(guī)則的細(xì)胞溶解免疫突觸的形成。人工免疫突觸是一個(gè)高度組織化的結(jié)構(gòu)，與生理拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)具有相同的特征。腫瘤和T細(xì)胞之間的膜間距非常重要，因此，抗體尺寸是突觸形成的一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)。短結(jié)合臂對(duì)膜遠(yuǎn)端抗原更有效

為了比較不同雙抗形式的結(jié)合臂與形成人工免疫突觸誘導(dǎo)T細(xì)胞活化能力之間的關(guān)系，實(shí)驗(yàn)人員設(shè)計(jì)了一種新的雙特異性diabody Fc（DbFc）格式，它采用了更緊湊的構(gòu)型。與的基于IgG的分子形式相比，兩個(gè)抗原識(shí)別臂之間的距離估計(jì)分別為3–6 nm和9–15 nm。

此外，為了系統(tǒng)地研究抗原表位位置在T細(xì)胞導(dǎo)向療法中的作用，實(shí)驗(yàn)人員通過(guò)將表皮生長(zhǎng)因子（EGF）樣結(jié)構(gòu)域作為相對(duì)剛性的結(jié)構(gòu)間隔物，設(shè)計(jì)了一系列表達(dá)BCMA抗原的細(xì)胞系，這些細(xì)胞系以不同的EGF樣結(jié)構(gòu)域作為系鏈，以增加到靶細(xì)胞膜的距離。

研究發(fā)現(xiàn)，在24小時(shí)的效應(yīng)器靶標(biāo)比（E：T比）為5：1時(shí)，所有三種分子在誘導(dǎo)T0細(xì)胞系裂解方面表現(xiàn)出幾乎相等的活性，T0細(xì)胞系在細(xì)胞表面呈現(xiàn)BCMA而沒(méi)有任何栓系。隨著到細(xì)胞表面的距離隨著EGF樣結(jié)構(gòu)域數(shù)量的增加而增加，雙特異性IgG2誘導(dǎo)T細(xì)胞定向裂解的能力迅速減弱，而Db和DbFc在細(xì)胞系T0到T5中顯示出相當(dāng)強(qiáng)的細(xì)胞毒性，T6和T7中的效力顯著降低。

這說(shuō)明雙特異性抗體分子使T細(xì)胞與靶細(xì)胞接近的程度對(duì)免疫突觸形成的效率有重要影響。全長(zhǎng)IgG和Db衍生分子的差異可以用兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的臂距來(lái)解釋，因?yàn)镈b和DbFc結(jié)構(gòu)更為堅(jiān)硬和緊湊，導(dǎo)致T細(xì)胞和抗原表達(dá)細(xì)胞之間的距離相對(duì)較短，當(dāng)超過(guò)T細(xì)胞活化的距離閾值時(shí)，雙抗的殺傷功能就會(huì)明顯下降。

長(zhǎng)結(jié)合臂對(duì)膜近端抗原更有效

然后實(shí)驗(yàn)人員檢查了相反的情況，抗原表位位于膜的近端區(qū)域，并被其上不同數(shù)量的結(jié)構(gòu)單元所掩蓋。

于沒(méi)有任何掩蔽的M0v細(xì)胞系，兩種分子在15小時(shí)和24小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)顯示出幾乎不可區(qū)分的EC50和Emax，24小時(shí)的數(shù)據(jù)清楚地顯示出更高的最大殺傷率和顯著的左移EC50。對(duì)于M2v和M4v，在15小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)，DbFc活性明顯低于基于IgG的分子。

然而，這兩種分子的劑量－效應(yīng)曲線在24小時(shí)時(shí)趨于一致，這個(gè)結(jié)果可能是由于T細(xì)胞活化的動(dòng)力學(xué)差異導(dǎo)致，在足夠長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)，EGF樣結(jié)構(gòu)域可能具有一定的結(jié)構(gòu)靈活性，允許暴露膜近端BCMA抗原。對(duì)于M7v細(xì)胞系，即使在24小時(shí)，DbFc的Emax也穩(wěn)定在約50％，低于基于IgG的分子，這表明在這種情況下，即使是柔韌性也不能克服空間位阻來(lái)補(bǔ)償DbFc橋接CD3和BCMA的低概率。

靶向不同表位的雙抗與體外活性的關(guān)系

為了深入了解表位位置如何影響雙抗的細(xì)胞殺傷活性，實(shí)驗(yàn)人員在過(guò)度表達(dá)FLT3的EoL1急性髓系白血病（AML）細(xì)胞系上設(shè)計(jì)并研究了多種FLT3／ CD3雙特異性抗體分子。FLT3是一種受體酪氨酸激酶，其胞外結(jié)構(gòu)域由五個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域組成。

結(jié)果顯示，與一系列表達(dá)BCMA的工程細(xì)胞系的研究結(jié)果一致，針對(duì)FLT3不同結(jié)構(gòu)域的雙特異性分子顯示出顯著不同的細(xì)胞毒性，其受到分子形式的強(qiáng)烈影響。靶向膜遠(yuǎn)端結(jié)構(gòu)域D1和D3的DbFc介導(dǎo)了比其IgG對(duì)應(yīng)分子更有效的細(xì)胞毒性，可能是由于其使兩個(gè)細(xì)胞膜緊密結(jié)合的能力。

另一方面，針對(duì)膜近端結(jié)構(gòu)域D4和D5的IgG雙特異性分子誘導(dǎo)特異性靶細(xì)胞裂解，而對(duì)于DbFc形式的相同抗FLT3抗體，在高達(dá)10 nM的濃度下未觀察到顯著的細(xì)胞毒性。

小結(jié)

通過(guò)使用兩種形式（基于IgG和DbFc）的雙抗，對(duì)抗原表位位置和雙抗分子激活T細(xì)胞的體外效力之間的關(guān)系進(jìn)行了研究。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)抗原表位位于膜遠(yuǎn)端區(qū)域時(shí)，DbFc形式更有效，而基于IgG的雙特異性分子對(duì)于被其他結(jié)構(gòu)域掩蓋的膜近端表位更有效。

此外，在更具生物學(xué)相關(guān)性的背景下，針對(duì)FTL3抗原不同結(jié)構(gòu)域的雙特異性分子證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)。因此，在設(shè)計(jì)T細(xì)胞導(dǎo)向療法的雙抗分子時(shí)，除了考慮抗體的親和力，分子形式，抗原特性之外，還需要注意不同雙抗形式與抗原結(jié)合表位位置的關(guān)系。

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