近年來,生物藥的市場需求逐年擴容,其中抗體藥物因其靶向性好,治療效果顯著,在生物藥中占據(jù)著舉足輕重的地位,目前已經(jīng)進入了抗體藥物發(fā)展的黃金時代。隨著抗體藥的需求越來越大,抗體篩選技術的發(fā)展也是日新月異,目前應用較普遍的有雜交瘤技術、抗體文庫篩選技術、B細胞克隆技術和轉(zhuǎn)基因小鼠抗體篩選技術。雜交瘤技術雜交瘤技術又稱為單克隆抗體技術,是在體細胞融合的技術基礎上發(fā)展而來的。這項技術將免疫動物的B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合,即可形成在體外長期存活并分泌免疫蛋白的雜交瘤細胞,通過克隆化可得到來自單個雜交瘤細胞的單克隆系,即雜交瘤細胞系,利用雜交瘤細胞可以大量的生產(chǎn)單克隆抗體。                          

1975年,Kohler和Milstein在劍橋大學醫(yī)學委員會分子生物學實驗室,成功把免疫小鼠的脾臟B淋巴細胞和骨髓瘤細胞融合,形成了B細胞-骨髓瘤雜合體。這種細胞雜合體既能在體外培養(yǎng)中無限地快速增殖且存活,又能分泌抗羊紅細胞的單克隆抗體。同年8月7日,Kohler和Milstein在英國《自然》雜志上發(fā)表了題為(Continuous culturesoff  used cells secreting antibody of predefined specificity)的著名論文,正式提出了雜交瘤這一概念。1984年,因其對免疫學做出的貢獻,他們與Niels K． Jerne共同榮獲諾貝爾生理學和醫(yī)學獎。

細胞融合技術是雜交瘤技術的基礎,通過聚乙二醇(PEG)(最常用)、仙臺病毒、電轉(zhuǎn)等方法對細胞進行人工誘導,可使兩個細胞通過膜融合形成單個細胞。融合細胞的篩選 HAT培養(yǎng)基篩選技術是雜交瘤技術中另一個關鍵的技術,在B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合后,會產(chǎn)生多種融合結(jié)果(未融合的骨髓瘤細胞、未融合的B淋巴細胞、B淋巴細胞自身融合細胞、骨髓瘤細胞自身融合細胞、正確融合的雜交瘤細胞),為了得到所需的雜交瘤細胞,必須利用 HAT 培養(yǎng)基對融合后的細胞進行篩選。HAT培養(yǎng)基的篩選原理為:DNA合成途徑有生物合成途徑與應急合成途徑兩種,HAT培養(yǎng)基中含有次黃嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷酸(T)等物質(zhì),氨基喋呤可以對 DNA的生物合成途徑進行阻斷,骨髓瘤細胞會因為生物合成途徑被阻斷且自身缺乏應急合成途徑導致不能增殖進而快速的死亡;而B淋巴細胞因缺乏體外增殖的能力,一般在10天左右死亡;雜交瘤細胞具有體外增殖能力且由于次黃嘌呤與胸腺嘧啶核苷酸的存在,可以通過應急途徑合成DNA并在 HAT培養(yǎng)基中正常生長,不會死亡。因此將融合后的細胞放于 HAT 培養(yǎng)基中培養(yǎng),其他的融合結(jié)果會全部死亡,最終篩選出雜交瘤細胞。噬菌體展示技術1985年Smith GP利用基因工程,將外源基因插入絲狀噬菌體(Filamentous bacteriophage,fd)的基因組,使目的基因編碼的多肽以融合蛋白的形式展示,從而創(chuàng)建了噬菌體展示技術。其因在噬菌體展示相關研究方面的貢獻在2018年獲得了諾貝爾化學獎。1990年,Mc Cafferty等利用噬菌體展示技術構(gòu)建了庫容為106的抗體庫,使其成為一種新興的抗體制備技術。而SirGregory P． Winter是第一個利用噬菌體展示技術將鼠源抗體藥物人源化,使得抗體藥物用于臨床治療,比如Adalimumab。噬菌體展示技術(phage display)是將外源編碼多肽或蛋白質(zhì)的基因通過基因工程技術插入到噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當位置,在閱讀框能正確表達,使外源多肽或蛋白在噬菌體的衣殼蛋白上形成融合蛋白,隨子代噬菌體的重新組裝呈現(xiàn)在噬菌體表面,可以保持相對的空間結(jié)構(gòu)和生物活性。然后利用靶分子,采用合適的淘洗方法,洗去未特異性結(jié)合的噬菌體。再用酸堿或者競爭的分子洗脫下結(jié)合的噬菌體,中和后的噬菌體感染大腸桿菌擴增,經(jīng)過3-5輪的富集,逐步提高可以特異性識別靶分子的噬菌體比例,最終獲得識別靶分子的多肽或者蛋白。

除了噬菌體展示技術之外,基于文庫展示的技術還包括:酵母展示技術、核糖體展示技術以及細胞展示技術等。B細胞克隆技術通過經(jīng)典免疫學的研究,我們已經(jīng)了解,人和動物接受了外源性免疫原(如細菌、病毒、非同源蛋白等)的刺激后,獲得性免疫(Adaptive Immunity)被激活,并在 T 淋巴細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞等免疫細胞的協(xié)同作用下,由 B 淋巴細胞產(chǎn)生針對于該病原體(或免疫原)的抗體分子;B 淋巴細胞經(jīng)過一系列的成熟和分化之后,最終形成漿細胞(Plasma cell)將大量的 IgG 分泌到血液等循環(huán)系統(tǒng)中;而特定的某一個 B 淋巴細胞在經(jīng)歷了 V-D-J 重排、Class Switch 和 Somatic maturation 之后,只含有一對編碼 IgG 重鏈和輕鏈的基因。因此,經(jīng)過 B 淋巴細胞表面標記物和抗原特異性篩選,可以獲得針對特異性抗原的單個 B 淋巴細胞,然后通過分子生物學手段從中獲得編碼抗體 IgG 的重鏈和輕鏈基因,并在體外重組表達驗證,是目前獲得單克隆抗體最有效和快速的技術。基于單 B 細胞篩選的抗體發(fā)現(xiàn)技術發(fā)展,還得益于流式細胞技術、微流控技術(Microfluidic)以及光流體技術(Optofluidic)等相關生物技術的發(fā)展和成熟,使其成功的從實驗室走向商業(yè)化應用,并在單克隆抗體特別是治療性單克隆抗體的開發(fā)方面被廣泛應用。

基于單 B 細胞分選技術的單克隆抗體開發(fā)平臺,和傳統(tǒng)的單克隆抗體開發(fā)平臺相比,最突出的優(yōu)勢在于能夠從人體內(nèi)直接篩選獲得全人源單克隆抗體;同時,也能夠大大縮短研發(fā)周期,從獲得康復病人的外周血淋巴細胞開始,一般來說在 4-6 周內(nèi)即可獲得全人源單克隆抗體,并完成相應的生物學功能實驗(如病毒結(jié)合和中和實驗、ADCC 實驗等);并且由于所獲得是全人源單克隆抗體,可以大大簡化甚至于不需要抗體人源化改造工程,快速推進至臨床試驗。　　

轉(zhuǎn)基因小鼠全人源抗體篩選技術早在1985年,Alt等人就曾提出可以應用轉(zhuǎn)基因技術得到具有人源序列的單克隆抗體。1989年,Bruggemann等人在小鼠中表達了人源重鏈,從而產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因編碼的免疫應答。而在1994年,Lonberg和Jakobovits的團隊分別采用了不同的方法構(gòu)建了能夠表達人源抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠。Lonberg利用了核內(nèi)顯微注射的方法,而Jakovovits用的是酵母人工染色體(YAC)的方法。重鏈包含3個重鏈可變區(qū)(VH),16個D,所有的6個JH區(qū)。Abgenix的XenoMouse?是第一個同時有大部分人源VH和人源Vκrepertoire的轉(zhuǎn)基因小鼠品系。這些XenoMouse?小鼠有百萬堿基對大小的酵母人工染色體,在重鏈基因座,有34個有功能的VH基因,全部的DH和JH區(qū)域,作為Cμ和Cδ功能下游的人源Cγ2基因;κ輕鏈基因座含有18個Vκ基因,全部五個功能性的Jκ區(qū),和Cκ基因。由于YAC可以整合到小鼠染色體中,這樣得到的小鼠具有較好的基因穩(wěn)定性。2005年,安進以22億美元收購Abgenix。XenoMouse平臺上開發(fā)出的第一個單抗藥物是Abgenix和安進共同開發(fā)的抗EGFR單抗panitumumab(于2006．9被FDA批準),這也是基于轉(zhuǎn)基因小鼠的第一個全人源單抗藥物。

另一個用于產(chǎn)生全人源抗體的小鼠是GenPharmInternational, Inc開發(fā)的HuMab?或者叫Ultimab?。1997年,Medarex收購了該公司獲得這一技術平臺。2009年,BMS以24億美元收購Medarex,將Humab小鼠收入囊中。這一平臺可產(chǎn)生高親和力(納摩到亞納摩級別)的人源抗體。

Ofatumumab是基于Ultimab平臺開發(fā)出的抗CD20單抗,它和同為CD20抗體的rituximab靶向的表位不同。Ofatumumab于2009年十月被FDA批準用于治療慢性淋巴細胞白血病。Ultimab平臺還有一系列諸如Canakinumab(抗interleukin-1β的IgG1單抗,用于治療一種罕見的自身炎癥性疾病Cryopyrin蛋白相關周期性綜合征), Ustekinumab(靶向IL-12和IL-23所共有的p40亞單位,用于18歲及以上活動性銀屑病關節(jié)炎患者的治療)等單抗產(chǎn)生。