侵權(quán)投訴
訂閱
糾錯
加入自媒體

從RNA提取到Real Time PCR

01

背景介紹

核糖核酸(縮寫為RNA,即Ribonucleic Acid),存在于生物細(xì)胞(主要分布在細(xì)胞質(zhì)中)以及部分病毒、類病毒中的遺傳信息載體,是以DNA的一條鏈為模板,以堿基互補(bǔ)配對原則,轉(zhuǎn)錄而形成的一條單鏈,主要功能是實(shí)現(xiàn)遺傳信息在蛋白質(zhì)上的表達(dá),是遺傳信息向表型轉(zhuǎn)化過程中的橋梁。

02

實(shí)驗(yàn)流程

一、細(xì)胞RNA的提取

研究基因的表達(dá)和調(diào)控時常常要從組織和細(xì)胞中分離和純化RNA。RNA質(zhì)量的高低常常影響cDNA庫,RT-PCR和Northern Blot等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的成敗。Trizol是一種總RNA抽提試劑,內(nèi)含異硫氰酸胍等物質(zhì),能迅速破碎細(xì)胞,抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶。

實(shí)驗(yàn)所需試劑和材料:Trizol(4℃保存)、無水乙醇、氯仿(三氯甲烷)、DEPC水、異丙醇(-20℃預(yù)冷備用)、移液槍槍頭(RNase-free)、 EP管(RNase-free)。

實(shí)驗(yàn)操作流程:

1.樣品準(zhǔn)備:將細(xì)胞接種于6孔板中,經(jīng)干擾和加藥處理后,吸棄培養(yǎng)基,每孔加1mL處理細(xì)胞用PBS漂洗細(xì)胞兩次。每孔加1 mL TRIzol Regent,4℃;

2.裂解20 min 裂解細(xì)胞。之后用移液器輕輕吹打,使裂解物均勻,并用移液器轉(zhuǎn)移至 RNase-free的1.5 mL離心管中,可放于-80℃保存;

3.超凈臺臺面,實(shí)驗(yàn)所需材料用75%酒精擦拭并紫外照射30min滅菌。通風(fēng)10min后進(jìn)行實(shí)驗(yàn);

4.冰上完全溶解樣品,向每管裂解物中加入200 μL氯仿,蓋好管蓋,上下輕輕顛倒混勻20s,冰浴 5 min;

5.混合物置于 4℃,12000 r/min離心15 min;吸棄上清,置于超凈臺中室溫放置15 min;

6.離心后,樣品分為三層,上層水相為RNA,中層沉淀為蛋白質(zhì)和DNA,下層為多糖等。小心吸出上層水相400μL(400μL就夠了,建議切勿貪多),轉(zhuǎn)移到新的EP管中;

7.每1 mL裂解物加400 μL預(yù)冷的異丙醇,輕柔顛倒混勻15 s后置于-20℃、1 h沉降RNA;

8.-20℃沉降 1 h 后,沉降體系于4℃,12000 r/min 離心10 min。后打開離心管蓋,將離心管放平,小心傾倒其中液體,保留沉淀;

9.每管1 mL 預(yù)冷的 75%乙醇溶液,蓋好管蓋,用力震蕩離心管懸浮沉淀,漂洗沉淀。后于 4℃ 13000 r/min 離心 10 min,吸棄上清,保留沉淀;

10.吸棄上清的離心管倒置于超凈工作臺中,風(fēng)干10 min;

11.每管加入適量DEPC處理水,溶解RNA沉淀;

12.利用超微量核酸定量儀測定RNA濃度。

注意事項(xiàng):RNA易分解,實(shí)驗(yàn)在超凈工作臺進(jìn)行是不需要點(diǎn)燃酒精燈,需避火操作。RNase酶是導(dǎo)致RNA降解的最主要的物質(zhì),可以水解RNA的磷酸二酯鍵,廣泛存在于人的皮膚上,因此,在RNA制備有關(guān)的分子學(xué)實(shí)驗(yàn)時,必須戴手套,并且RNA提取實(shí)驗(yàn)中所使用的移液器和EP管需是RNase-free物品。由于DEPC的劇毒性,實(shí)驗(yàn)室是現(xiàn)在一般槍頭與EP管高壓滅菌3次以上。DEPC水現(xiàn)可由市面上的無菌水/RNase-free水代替。

二、運(yùn)用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA

利用Promega 公司生產(chǎn)的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)體系為2 μg RNA,25 μL體系實(shí)驗(yàn)試劑:dNTP(4 ℃保存),M-MLV(-20 ℃保存),RNasin(-20 ℃保存)。

1.超凈臺中取EP管進(jìn)行標(biāo)注,按照圖1,每管加入5 μL的隨機(jī)引物,同時加入2 μg的RNA模板,混勻后置于70℃的恒溫孵育器中5 min,使得隨機(jī)引物與模板鏈孵育結(jié)合,然后迅速置于冰上進(jìn)行冷卻;

2.每管按照5 μL 10 M的dNTP、5 μL的5×Buffer、0.625 μL的RNase inhibitor? 以及1 μL的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(酶放置于冰盒中)配制成預(yù)混液,分裝至每個EP管,用DEPC水補(bǔ)齊至終體積25 μL;

3.漩渦震蕩混勻離心之后,置于37℃恒溫孵育器中孵育1 h;

4.調(diào)節(jié)溫度至70℃終止反應(yīng),10min,得到的cDNA至-20℃冰箱中保存?zhèn)溆。逆轉(zhuǎn)錄的過程中需操作迅速、謹(jǐn)防污染;需注意cDNA 不穩(wěn)定,切勿反復(fù)凍融。

三、實(shí)時定量PCR

常規(guī)PCR中,擴(kuò)增產(chǎn)物(擴(kuò)增子)是通過終點(diǎn)法來分析檢測,即 PCR 反應(yīng)結(jié)束后,DNA 通過瓊脂糖凝膠電泳,然后進(jìn)行成像分析。而熒光定量 PCR 可以在反應(yīng)進(jìn)行過程中進(jìn)行累積擴(kuò)增產(chǎn)物的分析和檢測,即“實(shí)時”。

在反應(yīng)體系中加入熒光分子,通過熒光信號的按比例增加來反應(yīng) DNA 量的增加,使 PCR 產(chǎn)物的實(shí)時檢測成為可能。利用熒光信號累積實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行總量分析或通過Ct值對模板進(jìn)行相對定量。RT-PCR技術(shù)可用于檢測細(xì)胞和組織中基因表達(dá)水平,克隆特定基因 cDNA序列和檢測RNA病毒。

(1)實(shí)時定量PCR具體操作:

按照圖中體系在1.5 mL的EP管中配制反應(yīng)預(yù)混物,漩渦震蕩混勻之后,按照預(yù)先安排的順序分裝至八連管中。分裝至八連管之后按照循序加模板,為保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性,樣品每組做3個平行,并根據(jù)引物的數(shù)量設(shè)置陰性對照。預(yù)混應(yīng)體系配制過程中全程避光,配好以后置于掌式離心機(jī)離心數(shù)秒,使所有組分沉降于八連管底部。錫箔紙包住EP板,轉(zhuǎn)移至Real time PCR反應(yīng)儀器中,設(shè)置反應(yīng)程序后,點(diǎn)“Start”啟動反應(yīng)。

(2)連機(jī)依次設(shè)置參數(shù)如下:

a、StepOne Instrument(48 wells):根據(jù)儀器規(guī)格選擇48孔/96孔;

b、Quantitation(相對定量):選擇相對定量的方式,目的基因與內(nèi)參基因Ct數(shù)值;數(shù)值;

c、Comparative(△△Ct):采用△△Ct法對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理;

d、SYBR Green:所選試劑中的熒光染料為SYBR Green;

e、cDNA:選用的模板為cDNA,進(jìn)行特異性的擴(kuò)增;

f、輸入待測靶基因的數(shù)目同時輸入相應(yīng)靶基因名稱;

g、輸入待測樣品的數(shù)量、設(shè)置平行性個數(shù)、靶基因的陰性對照及相應(yīng)的待測樣品的名稱;

h、設(shè)置樣品中的control組及陰性對照組;

i、實(shí)時PCR的反應(yīng)條件如下表所示。

Stage 1

預(yù)變性

Stage 2

PCR反應(yīng)

Stage 3

溶解曲線

95℃ 2 min

95℃ 10 s

60℃ 30 s

40個循環(huán)

95℃ 1 min

55℃ 1 min

95℃ 15 s

正確的實(shí)驗(yàn)技巧是成功的熒光定量 PCR 反應(yīng)重要然而常被忽視的要素。為得到最佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,實(shí)驗(yàn)人員要盡可能減少樣品間交叉污染的可能,避免將核酸從一個實(shí)驗(yàn)帶入下一個實(shí)驗(yàn)。以下措施有助于避免實(shí)驗(yàn)污染問題:

? 在樣品準(zhǔn)備和配制反應(yīng)液過程中勤換手套

? 使用清潔的移液槍

? 只使用 PCR 級的水和 PCR 專用試劑進(jìn)行 PCR 實(shí)驗(yàn)

? 用帶旋蓋的 EP 管稀釋和配制反應(yīng)液

四、數(shù)據(jù)分析

1.RT-PCR結(jié)束后,我們可以看到整個擴(kuò)增階段,分為四個階段,對數(shù)據(jù)進(jìn)行一個分析。

2.基線就是擴(kuò)增曲線中的水平部分。

基線:反應(yīng)熒光明顯增加前的背景熒光值。默認(rèn)為3-15Cycles的信號值。

3.閾值:在擴(kuò)增曲線的指數(shù)增長區(qū)域內(nèi)適當(dāng)位置上設(shè)定的熒光檢出界限。

4.CT值是從基線到指數(shù)增長的拐點(diǎn)所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。

5.Real time PCR 靈敏性強(qiáng),故對樣品質(zhì)量及引物質(zhì)量要求很高。為避免非特異性擴(kuò)增導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值不準(zhǔn)確,建議大家在每次實(shí)驗(yàn)時都要設(shè)置溶解曲線程序。只有溶解曲線為單一峰,才能認(rèn)為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠。

具體計(jì)算方式為:

先看Ct值,每個基因的三個平行中,舍去差異較大的值,求出平均值。

求組內(nèi)△Ct=組內(nèi)目的基因 Ct – 內(nèi)參 Ct

求組間△△Ct=組間實(shí)驗(yàn)組的△Ct - control組的△Ct

求值:公式(power)=2-△△C

以上便是從細(xì)胞RNA提取到Real Time PCR的全過程,在整個實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備及操作過程都需要仔細(xì)小心、按要求進(jìn)行操作,從而增加實(shí)驗(yàn)的成功率。

       原文標(biāo)題 : 從RNA提取到Real Time PCR

聲明: 本文由入駐維科號的作者撰寫,觀點(diǎn)僅代表作者本人,不代表OFweek立場。如有侵權(quán)或其他問題,請聯(lián)系舉報(bào)。

發(fā)表評論

0條評論,0人參與

請輸入評論內(nèi)容...

請輸入評論/評論長度6~500個字

您提交的評論過于頻繁,請輸入驗(yàn)證碼繼續(xù)

  • 看不清,點(diǎn)擊換一張  刷新

暫無評論

暫無評論

醫(yī)療科技 獵頭職位 更多
文章糾錯
x
*文字標(biāo)題:
*糾錯內(nèi)容:
聯(lián)系郵箱:
*驗(yàn) 證 碼:

粵公網(wǎng)安備 44030502002758號