概述 

近年來，嵌合抗原受體（CAR）T細(xì)胞療法治療血液惡性腫瘤成為細(xì)胞治療的一項重大突破。迄今為止，美國食品和藥物管理局（FDA）已經(jīng)批準(zhǔn)了六種CAR-T療法，用于治療非霍奇金淋巴瘤、B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病和多發(fā)性骨髓瘤。

目前，注冊的大多數(shù)臨床試驗(yàn)都基于所謂的第二代CAR，其由一個細(xì)胞外抗原結(jié)合區(qū)、一個共刺激域和一個CD3z信號域組成。不幸的是，盡管總體治療效果顯著，但仍有相當(dāng)高比例的患者沒有從CAR-T治療中獲益，總體應(yīng)答率在50%至100%之間，由于應(yīng)答的持久性有限，后續(xù)復(fù)發(fā)率高達(dá)66%。此外，它還與細(xì)胞因子釋放綜合征和神經(jīng)毒性等不良反應(yīng)有關(guān)。

免疫學(xué)和分子工程的進(jìn)展推動了新一代CAR-T細(xì)胞的構(gòu)建，這些細(xì)胞武裝了各種分子機(jī)制，包括額外的共刺激域、安全開關(guān)、免疫檢查點(diǎn)調(diào)節(jié)、細(xì)胞因子表達(dá)或治療干擾分子的敲除等。從而可以克服CAR-T療法當(dāng)前的局限性，增強(qiáng)療效并減少不必要的副作用。目前，許多臨床試驗(yàn)?zāi)壳罢�在評估新型CAR-T療法的安全性和有效性。

CAR的結(jié)構(gòu)

隨著CAR-T細(xì)胞技術(shù)越來越成熟，CAR結(jié)構(gòu)的組成，特別是細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域也在不斷進(jìn)化。第一代CAR-T細(xì)胞結(jié)構(gòu)包含腫瘤相關(guān)抗原的高親和力單鏈抗體（scFv）、跨膜結(jié)構(gòu)域和唯一的細(xì)胞內(nèi)TCR-ζ或FcR-γ結(jié)構(gòu)域。G1 的臨床益處有限，主要是由于其增殖能力低和體內(nèi)細(xì)胞毒性有限。為了克服這一缺點(diǎn)，第二代CAR結(jié)構(gòu)配備了額外的細(xì)胞內(nèi)共刺激結(jié)構(gòu)域，最顯著的是CD28或TNFRSF成員4-1BB。這些CARs被證明是非常有效的，幾種CAR-T產(chǎn)品在治療血液瘤方面獲得了監(jiān)管部門的批準(zhǔn)。

第三代CAR-T結(jié)構(gòu)包含了共刺激結(jié)構(gòu)域的組合，而第四代和第五代CAR-T細(xì)胞包含額外的共刺激結(jié)構(gòu)域，在抗原識別時誘導(dǎo)表達(dá)細(xì)胞因子（例如IL-12），或包含某些細(xì)胞因子受體的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（例如，截短的IL-2受體β鏈和STAT3結(jié)合部分）。

免疫檢查點(diǎn)調(diào)節(jié)的武裝CAR-T細(xì)胞 

CAR-T治療中的免疫檢查點(diǎn)調(diào)節(jié)旨在規(guī)避抑制性的腫瘤微環(huán)境。在血液腫瘤方面，評估該方法的所有臨床試驗(yàn)都明確依賴于破壞程序性細(xì)胞死亡蛋白1（PD-1）途徑。盡管試驗(yàn)數(shù)量相對較少（n=8），但個別研究顯示了調(diào)節(jié)PD-1信號的獨(dú)特方法。

在NCT03258047臨床試驗(yàn)中，研究人員使用了一種創(chuàng)新方法，其中PD-1融合到細(xì)胞內(nèi)CD28激活域。因此， PD-L1與PD-1的結(jié)合轉(zhuǎn)化為激活信號，預(yù)期會產(chǎn)生更有效的抗腫瘤效果。該研究涉及17名患有B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤的受試者。結(jié)果顯示，完全緩解率（CR）和客觀緩解率（ORR）分別為41.2%和58.8%。與已批準(zhǔn)的復(fù)發(fā)/難治性（r/r）DLBCL的第二代CAR-T療法相比（CR52%，ORR 72%），沒有顯示出優(yōu)勢。此外，NCT03932955臨床試驗(yàn)正在研究相同的免疫檢查點(diǎn)調(diào)節(jié)方法，目前沒有任何結(jié)果。

破壞PD-1信號的另一種探索方法是重編程CAR-T細(xì)胞以分泌PD-1-Fc融合蛋白。目前，兩項研究正在評估這種方法在r/r多發(fā)性骨髓瘤（NCT04162119）和r/r B細(xì)胞淋巴瘤（NCT0416 3302）中的安全性和有效性。然而，目前尚未發(fā)表任何臨床數(shù)據(jù)。

在臨床試驗(yàn)NCT04836507中，研究人員在r/r大B細(xì)胞淋巴瘤（LBCL）患者中測試了anbalcabtagene autoleucel (Anbal-cel)。這種新型CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品敲除PD-1和TIGIT受體。Anbal-cel顯示出令人印象深刻的結(jié)果，CR為78%。此外，還在NCT03208556臨床試驗(yàn)中評估了PD-1的敲除。

除PD-1通路調(diào)節(jié)外，NCT04037566臨床試驗(yàn)正在評估另一種武裝CAR-T細(xì)胞構(gòu)建。造血祖細(xì)胞激酶1（HPK1）表達(dá)降低的CAR-T細(xì)胞——一個陰性的細(xì)胞內(nèi)免疫檢查點(diǎn)，顯示了有希望的初步結(jié)果。在所有入選患者中，72.7%的患者達(dá)到CR或CRi，與FDA批準(zhǔn)的抗CD19療法相當(dāng)。

TRUCKs–表達(dá)細(xì)胞因子的CAR-T細(xì)胞

重定向用于通用細(xì)胞因子介導(dǎo)殺傷的T細(xì)胞（TRUCKs）是新一代CAR-T細(xì)胞，被設(shè)計為表達(dá)某些細(xì)胞因子，以增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤效力，提高其持久性，并改變腫瘤微環(huán)境的特征。

目前，六項臨床試驗(yàn)正在評估TRUCKs治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤。四項臨床試驗(yàn)（NCT04381741、NCT03929107、NCT04833504、NCT03778346）正在評估表達(dá)IL-7和趨化因子CCL19的CAR-T細(xì)胞。IL-7促進(jìn)T細(xì)胞的增殖和存活，而CCL19引導(dǎo)CAR-T細(xì)胞的腫瘤歸巢。研究結(jié)果顯示， r/r DLBCL的患者的CR率為4/7，ORR為5/7。此外，NCT03778346在r/r多發(fā)性骨髓瘤（MM）患者也探索了相同的方法，其中兩名入選患者獲得了CR（100%）。

另一種分泌細(xì)胞因子IL-18的CAR-T細(xì)胞正在NCT04684563臨床試驗(yàn)中進(jìn)行評估。IL-18在CAR-T細(xì)胞中表達(dá)以增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞增殖和抗腫瘤活性。然而，IL-18也與腫瘤進(jìn)展相關(guān)，因此，關(guān)于表達(dá)IL-18的CAR-T細(xì)胞在臨床中的安全性的長期結(jié)果有待觀察。

NCT03602157臨床試驗(yàn)代表了在CAR-T細(xì)胞中利用細(xì)胞因子信號的不同方法。研究人員構(gòu)建了一種表達(dá)CCR4的抗CD30 CAR-T細(xì)胞，用于治療r/r霍奇金淋巴瘤和皮膚T細(xì)胞淋巴瘤（CTCL）。該受體與CCL17結(jié)合，進(jìn)而改善CAR-T細(xì)胞向腫瘤部位的運(yùn)輸�；羝娼鹆馨土鲫犃性囼�(yàn)的初步結(jié)果是樂觀的，6名入選患者獲得CR（75%），而所有患者均獲得ORR（100%）。不幸的是， CTCL組沒有人獲得緩解。

安全開關(guān)的CAR-T細(xì)胞

常規(guī)CAR-T療法伴隨的治療相關(guān)毒性促進(jìn)了安全開關(guān)CAR-T細(xì)胞的構(gòu)建。新技術(shù)使研究人員能夠結(jié)合安全開關(guān)，通過在給予外源藥物后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性（CDC）或抗體依賴性細(xì)胞細(xì)胞毒性（ADCC）來清除CAR-T細(xì)胞。

將截短的表皮生長因子受體（EGFRt）結(jié)合到CAR-T細(xì)胞中是臨床試驗(yàn)中常見的安全開關(guān)方法。EGFRt被cetuximab靶向，其能夠通過CDC或ADCC去除。截至2022年8月，20項臨床試驗(yàn)正在研究多種血液系統(tǒng)惡性腫瘤中基于EGFRt的CAR-T細(xì)胞。目前，沒有關(guān)于在人體中啟動EGFRt安全開關(guān)機(jī)制的可用數(shù)據(jù)。缺乏此類報告的原因可能是調(diào)查期間沒有危及生命的不良事件。

在藥效方面，在CD19陽性的惡性腫瘤中，臨床試驗(yàn)顯示了不同的初步結(jié)果。NCT03085173研究報告的總CR率為57%，DLBCL患者的CR率為88%，而CLL患者為22%。在關(guān)于B-NHL患者的臨床試驗(yàn)中，NCT02706405的完全應(yīng)答率為42%，NCT02153580中為45%，NCT01815749中為75%。

RQR8自殺基因是治療給藥后控制CAR-T細(xì)胞的類似方法。RQR8基因編碼源自CD20和CD34抗原表位的細(xì)胞表面蛋白。該策略能夠在給予rituximab后通過CDC或ADCC清除CAR-T細(xì)胞。目前，NCT03590574臨床試驗(yàn)正在研究外周T細(xì)胞淋巴瘤（PTCL）中基于RQR8的CAR-T細(xì)胞。初步結(jié)果顯示，ORR為67%，56%的患者實(shí)現(xiàn)了完全代謝反應(yīng)（CMR）。另一項試驗(yàn)NCT03287804因治療多發(fā)性骨髓瘤的初步療效不理想而終止。

誘導(dǎo)型半胱天冬酶9（iCasp9）的加入是CAR-T安全開關(guān)的一種獨(dú)特方法。在給予AP1903后，特別修飾的胱天蛋白酶9發(fā)生二聚并觸發(fā)凋亡途徑。目前，17項臨床試驗(yàn)正在評估基于iCasp9的CAR-T細(xì)胞，但其中只有4項提供了初始數(shù)據(jù)。NCT03016377臨床試驗(yàn)報告了一例ALL患者在CAR-T輸注后出現(xiàn)神經(jīng)毒性。AP1903給藥后，癥狀完全緩解，唯一的不良事件是持續(xù)三天的2級膽紅素升高。有趣的是，盡管消除了90%以上的CAR-T細(xì)胞，研究人員仍觀察到臨床上顯著的抗白血病反應(yīng)。在NCT02274584試驗(yàn)中，僅發(fā)表了一例霍奇金淋巴瘤患者的病例報告，顯示暫時部分緩解。此外，NCT03125577試驗(yàn)報告了4名患者的數(shù)據(jù)，所有患者在CAR-T輸注后出現(xiàn)CR。

另一種可作為CAR-T療法安全開關(guān)的自殺基因是單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）Mut 2基因，其產(chǎn)物被前藥更昔洛韋（GCV）靶向。HSV-TK將GCV轉(zhuǎn)化為GCV三磷酸，通過破壞復(fù)制過程導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在終止的NCT04097301試驗(yàn)中評估了基于HSV-TK的CAR-T細(xì)胞。最終，只有兩名患者入選，且對治療無反應(yīng)。由于缺乏T細(xì)胞相關(guān)毒性，安全開關(guān)未被激活。

通用CAR-T細(xì)胞

如今，傳統(tǒng)CAR-T產(chǎn)品是由來自符合治療條件的患者的自體T細(xì)胞制造的。該方法存在若干局限性，包括制造時間長、難以動員適當(dāng)數(shù)量的T細(xì)胞以及嚴(yán)重治療患者的T細(xì)胞質(zhì)量降低。然而，利用分子工程產(chǎn)生異基因CAR-T細(xì)胞可以克服上述障礙。為了構(gòu)建通用CAR-T，需要從供體來源的細(xì)胞中去除主要組織相容性復(fù)合物（MHC）和T細(xì)胞受體（TCR）分子。

CRISPR/Cas9技術(shù)在T細(xì)胞工程中的初步安全性和可行性已在首次人體試驗(yàn)NCT03399448中得到證實(shí)。截至2022年8月，在ClinicalTrials.gov上已注冊了5項評估抗自相殘殺CAR-T細(xì)胞的臨床試驗(yàn)。在NCT04502446中，針對CD70抗原的CAR-T細(xì)胞被設(shè)計為消除TCR、MHC-I和CD70的表達(dá)，以消除自相殘殺并提高療效。結(jié)果顯示，ORR為47%，而CR為20%，未觀察到嚴(yán)重不良事件。此外，NCT04264078試驗(yàn)提供了在r/r T-ALL患者中使用通用CAR-T細(xì)胞的數(shù)據(jù)。通過CRISPR/Cas9破壞TCR和CD7基因，以防止GvHD和自相殘殺。結(jié)果顯示，CR為80%（4/5），但所有受試者的治療均與嚴(yán)重CRS相關(guān)（4名患者為3級，1名患者為4級）。后續(xù)入選患者的結(jié)果證實(shí)了該治療的高療效，CR為83%（5/6），而安全性結(jié)果與先前觀察結(jié)果一致。

小結(jié)

隨著研究數(shù)據(jù)的積累和分子工程的廣泛應(yīng)用，新一代CAR-T細(xì)胞治療在臨床上逐漸趨于成熟。最成功的新一代CAR-T細(xì)胞有可能是通用同種異體CAR-T細(xì)胞（使用CRISPR/Cas9技術(shù)制造），其特征在于免疫檢查點(diǎn)抗性，并表達(dá)將T細(xì)胞運(yùn)輸?shù)侥[瘤部位的細(xì)胞因子。此外，這種結(jié)構(gòu)將包含用于管理潛在毒性的安全開關(guān)機(jī)制。這種組合可能克服CAR-T細(xì)胞療法當(dāng)前的局限性，并有助于改善患者的治療結(jié)果。

參考文獻(xiàn)：

1.Nextgenerations of CAR-T cells - new therapeutic opportunities in hematology? FrontImmunol.2022 Oct 28;13:1034707.

       原文標(biāo)題 : 新一代CAR-T