實(shí)體瘤的CAR-T細(xì)胞治療:關(guān)鍵的經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)
前言
嵌合抗原受體(CAR)T細(xì)胞療法是一種過(guò)繼細(xì)胞療法,自體T細(xì)胞通過(guò)基因工程表達(dá)CAR以特異性殺死腫瘤細(xì)胞。自體CD19靶向CAR-T細(xì)胞目前已獲得大多數(shù)主要監(jiān)管機(jī)構(gòu)的批準(zhǔn),包括美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)、歐洲藥品管理局(EMA)和中國(guó)NMPA。這些CAR-T細(xì)胞改變了臨床實(shí)踐,顯示出強(qiáng)大的抗腫瘤活性,
然而,在實(shí)體瘤患者中開(kāi)發(fā)具有臨床實(shí)用性的CAR-T細(xì)胞仍然面臨重重困難,原因在很大程度上是未知的。有許多可能的原因,包括:(1)特異性不足的靶抗原;(2) 遞送不力;(3) 短持續(xù)性;(4) 效應(yīng)器功能喪失;和(5)腫瘤抗原異質(zhì)性。
因此,有必要從過(guò)往的CAR-T臨床前和臨床研究中汲取經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn),分析CAR-T細(xì)胞技術(shù)的要素和挑戰(zhàn),并將基礎(chǔ)、臨床和實(shí)踐等方面的因素考慮在內(nèi),采取應(yīng)對(duì)策略,從而使CAR-T技術(shù)能夠成為可負(fù)擔(dān)的治療模式。
了解CAR-T細(xì)胞在實(shí)體瘤中失敗的原因
遞送不力
CAR T細(xì)胞研究和開(kāi)發(fā)中需要回答的兩個(gè)基本問(wèn)題是,T細(xì)胞在靜脈注射后會(huì)去哪里,以及是它們進(jìn)入腫瘤的有效性。
模型的臨床前數(shù)據(jù)表明,很少有注射的CAR-T細(xì)胞最初進(jìn)入腫瘤,注射到同基因小鼠體內(nèi)的小鼠T細(xì)胞只持續(xù)幾周。人體的臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,CAR-T細(xì)胞最初在肺部和次級(jí)淋巴器官中積累,然后在接下來(lái)的24-48小時(shí)內(nèi)非常低效地轉(zhuǎn)移到腫瘤中。
CAR-T細(xì)胞進(jìn)入腫瘤首先需要識(shí)別內(nèi)皮細(xì)胞表面分泌并結(jié)合的趨化因子,內(nèi)皮細(xì)胞主要位于腫瘤間質(zhì)中,而不是腫瘤細(xì)胞富集區(qū)。這種最初的內(nèi)皮識(shí)別之后是由選擇素介導(dǎo)的滾動(dòng)粘附,然后是整合素的牢固粘附。在趨化因子(特別是CXCL9、CXCL10、CXCL11以及CCL5)的驅(qū)動(dòng)下,T細(xì)胞然后遷移到腫瘤基質(zhì)中。在這里,血管周?chē)?xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞(主要是成纖維細(xì)胞)組成了屏障。一些T細(xì)胞通過(guò)間質(zhì)遷移,更少的T細(xì)胞最終在腫瘤衍生趨化因子的引導(dǎo)下進(jìn)入腫瘤細(xì)胞富集區(qū),在那里它們可以殺死腫瘤細(xì)胞,這一過(guò)程需要與腫瘤細(xì)胞上的ICAM1結(jié)合。這一過(guò)程效率極低,導(dǎo)致很少的T細(xì)胞成功地與腫瘤細(xì)胞相互作用。這里存在許多缺乏效率的原因,包括趨化因子-CCR失配、粘附受體缺陷和充當(dāng)屏障的細(xì)胞外基質(zhì)。
另一個(gè)重要但被低估的問(wèn)題可能是CAR-T細(xì)胞向淋巴組織和遠(yuǎn)離實(shí)體瘤的“誤導(dǎo)”。到目前為止,CAR T細(xì)胞的制造主要受到在B細(xì)胞白血病或淋巴瘤患者中測(cè)試CD19靶向產(chǎn)品的試驗(yàn)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)指導(dǎo),這些試驗(yàn)強(qiáng)調(diào)了淋巴結(jié)和/或骨髓運(yùn)輸、抗腫瘤活性的擴(kuò)展和持久性的重要性。已知具有高水平CCR7和CD62L表達(dá)的T細(xì)胞優(yōu)先運(yùn)輸?shù)搅馨徒Y(jié)或骨髓。因此,大多數(shù)當(dāng)前方案的目標(biāo)是產(chǎn)生主要具有中樞記憶細(xì)胞(CD62L高和CCR7高CD45RO+)表型的CAR-T細(xì)胞,而不是效應(yīng)記憶細(xì)胞(CD 62L低和CCR7-低CD45RO++)表型,這通常不利于向腫瘤的轉(zhuǎn)移。
此外,應(yīng)考慮另外兩個(gè)注意事項(xiàng)。首先,冷凍保存可能會(huì)影響CD62L的表達(dá),從而影響運(yùn)輸。其次,CD62L被認(rèn)為通過(guò)其他機(jī)制促進(jìn)抗腫瘤活性,具體而言,CD62L可能引導(dǎo)T細(xì)胞向某些實(shí)體瘤中存在的三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)內(nèi)的高內(nèi)皮細(xì)胞微靜脈運(yùn)輸。這些淋巴結(jié)構(gòu)可能促進(jìn)T細(xì)胞浸潤(rùn),并改善抗腫瘤免疫反應(yīng)。
短持久性
在涉及實(shí)體瘤患者的臨床試驗(yàn)中,就CAR-T細(xì)胞的持久性而言,使用PCR或流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè),迄今為止進(jìn)行的幾乎每一項(xiàng)試驗(yàn)都顯示CAR-T細(xì)胞僅存在于血液樣本中。血液中CAR T細(xì)胞DNA轉(zhuǎn)錄物的范圍為每微克DNA103至104個(gè)拷貝,輸注后僅在約一個(gè)月內(nèi)檢測(cè)到CAR-T細(xì)胞,峰值通常出現(xiàn)在10-14天。相比之下,在白血病患者中測(cè)試CD19靶向CAR-T細(xì)胞的大多數(shù)成功試驗(yàn)都發(fā)現(xiàn),血液中有大量的CAR-T細(xì)胞,通常為每微克DNA 105-106個(gè)拷貝,其持續(xù)時(shí)間從幾個(gè)月到幾年不等。
總之,臨床前和臨床研究的結(jié)果表明,靜脈注射后,CAR-T細(xì)胞向腫瘤的轉(zhuǎn)運(yùn)效率非常低,而且大多數(shù)這種轉(zhuǎn)運(yùn)可能在注射后不久發(fā)生。從人類(lèi)研究中獲得的有限數(shù)據(jù)表明,進(jìn)入實(shí)體瘤的少數(shù)CAR-T細(xì)胞具有有限的持久性,并且不會(huì)廣泛增殖。
效應(yīng)器功能喪失
CAR-T細(xì)胞的臨床前研究一致發(fā)現(xiàn),它們的細(xì)胞毒性活性最初很高,但隨著時(shí)間的推移逐漸降低。基因組和表觀基因組的變化都與這種低功能狀態(tài)有關(guān)。誘發(fā)這種進(jìn)行性功能減退狀態(tài)的原因尚不完全清楚。可能與TME中存在的多種因素相關(guān),包括低pH、缺氧、由于關(guān)鍵氨基酸和葡萄糖水平低而導(dǎo)致的營(yíng)養(yǎng)缺乏、高水平的活性氧(ROS)、免疫抑制介質(zhì)(如TGF-β、PGE2、腺苷和IL-10)的存在,以及與骨髓來(lái)源的抑制細(xì)胞和CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的相互作用。T細(xì)胞內(nèi)在因素包括由免疫檢查點(diǎn)(如PD-1、CTLA4、TIM3、TIGIT和LAG3)和抑制性細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路(如DGK、NR4A、SHP1和cbl-b)介導(dǎo)的“調(diào)節(jié)性關(guān)閉”。此外,還有多種表觀遺傳學(xué)變化。
腫瘤異質(zhì)性與抗原擴(kuò)散
與B細(xì)胞惡性腫瘤或多發(fā)性骨髓瘤不同,實(shí)體瘤中的抗原表達(dá)幾乎總是較低且更異質(zhì)。因此,除非CAR-T細(xì)胞誘導(dǎo)某種旁觀者或抗原擴(kuò)散效應(yīng),或靶向多種抗原,否則成功治療的可能性很低。
我們可以汲取的經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)
某些實(shí)體瘤患者現(xiàn)在可以使用過(guò)繼性T細(xì)胞轉(zhuǎn)移成功治療,其中最顯著的成功是黑色素瘤患者的TIL治療。在非小細(xì)胞肺癌患者中使用TIL也取得了有希望的結(jié)果。我們可以從這些成功中學(xué)到什么,以使CAR-T細(xì)胞在實(shí)體瘤中取得更大的成功?
針對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移優(yōu)化的T細(xì)胞可能不是針對(duì)實(shí)體瘤的最佳細(xì)胞
與優(yōu)先運(yùn)輸至外周位點(diǎn)的效應(yīng)細(xì)胞或效應(yīng)記憶細(xì)胞相比,CD62L和CCR7在幼稚或中央記憶T細(xì)胞上的高表達(dá)能夠優(yōu)先運(yùn)輸至次級(jí)淋巴結(jié)和骨髓。當(dāng)用于開(kāi)發(fā)靶向?qū)嶓w瘤的CAR-T細(xì)胞時(shí),這些表型的細(xì)胞可能是次優(yōu)的。實(shí)體瘤導(dǎo)向的CAR-T細(xì)胞被設(shè)計(jì)為靶向在實(shí)體瘤細(xì)胞表面表達(dá)的完整抗原。因此,當(dāng)這些細(xì)胞進(jìn)入骨髓或淋巴結(jié)時(shí),它們將不會(huì)遇到它們的抗原,因此不會(huì)被激活以增殖或分化為效應(yīng)細(xì)胞,除非腫瘤已經(jīng)轉(zhuǎn)移到這些位置。數(shù)據(jù)顯示,在實(shí)體瘤模型中,效應(yīng)器CAR-T細(xì)胞比記憶T細(xì)胞更有效。因此,使用旨在優(yōu)化淋巴結(jié)運(yùn)輸?shù)臉?biāo)準(zhǔn)方案產(chǎn)生CAR-T細(xì)胞可能是實(shí)體瘤需要避免的一個(gè)關(guān)鍵教訓(xùn)。
DC交互可能很重要
TIL或TCR-T細(xì)胞和CAR T細(xì)胞之間的一個(gè)重要區(qū)別是前者可以被DC廣泛激活,DC可以提供最佳的共刺激信號(hào)。這種共刺激可以發(fā)生在淋巴結(jié)和骨髓中。找到利用DC激活能力的方法,以增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞增殖和持續(xù)的能力,是我們應(yīng)該嘗試從涉及TIL的試驗(yàn)中吸取的經(jīng)驗(yàn)。
可能不需要長(zhǎng)期持久性
普遍認(rèn)為,CAR-T細(xì)胞的成功與CAR-T細(xì)胞的持久性密切相關(guān)。然而,由于多種原因,在實(shí)體瘤患者中測(cè)試CAR-T細(xì)胞的臨床試驗(yàn)中,持久性的重要性尚未得到證實(shí)。此外,來(lái)自實(shí)體瘤模型的數(shù)據(jù)表明,CAR-T細(xì)胞的持久性與T細(xì)胞功能低下水平的增加有關(guān)。
解決這一難題的方法如修飾CAR-T細(xì)胞,使其更持久,更不易發(fā)生功能低下。過(guò)去幾年,使用這種方法在實(shí)體瘤患者中取得了一些令人鼓舞的成功。然而,另一種需要考慮的方法是不考慮持久性,而是使用多次給藥策略給予新鮮的CAR-T細(xì)胞。隨著時(shí)間的推移,注射的CAR-T細(xì)胞會(huì)耗盡,它們可以被新劑量的高活性CAR-T細(xì)胞取代。這種方法減少CAR成分的免疫原性是必要的,以避免多次給藥的細(xì)胞被排斥。
靶向多種腫瘤抗原很重要
除了激活機(jī)制的差異外,TIL和CAR-T細(xì)胞之間的一個(gè)重要差異是,前者本質(zhì)上是多克隆的,因此可能靶向不止一種抗原。任何成功治療實(shí)體瘤患者的CAR-T細(xì)胞療法都需要靶向多個(gè)腫瘤特異性靶點(diǎn),最佳地觸發(fā)某種旁觀者效應(yīng)或誘導(dǎo)抗原擴(kuò)散到內(nèi)源性免疫系統(tǒng)。例如,通過(guò)設(shè)計(jì)分泌FLT3配體的CAR-T細(xì)胞對(duì)DC的募集,以及使用4-1BB激動(dòng)劑的DC激活,以促進(jìn)內(nèi)源性T細(xì)胞反應(yīng)和抗腫瘤活性增強(qiáng)。
如何更好地開(kāi)發(fā)CAR-T
為了應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn),可以考慮通過(guò)優(yōu)化兩種不同的策略來(lái)向前邁進(jìn),以在實(shí)體瘤患者中取得更大的成功。策略1是該領(lǐng)域的當(dāng)前方向,基于為血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者開(kāi)發(fā)的傳統(tǒng)“記憶細(xì)胞”模式。策略2采用不同的“短命效應(yīng)細(xì)胞”模式。
策略1:記憶細(xì)胞模式
這種方法的目標(biāo)是最大限度地提高CAR-T細(xì)胞的運(yùn)輸和持久性,同時(shí)最大限度地降低CAR T功能低下的程度。作為策略的一部分,大劑量化療的淋巴結(jié)清除用于增強(qiáng)植入。CAR-T細(xì)胞的持久性和低功能已經(jīng)通過(guò)向T細(xì)胞引入特定的遺傳改變(如通過(guò)CRISPR)來(lái)抑制可能的抑制因子來(lái)解決,允許T細(xì)胞“休息”,從而防止慢性刺激,或直接通過(guò)使用能夠分泌細(xì)胞因子或其他蛋白質(zhì)的武裝CAR-T細(xì)胞來(lái)改變TME。
與該策略相關(guān)的一個(gè)主要挑戰(zhàn)是需要引入多種基因改變。在過(guò)去的幾年里,許多研究已經(jīng)能夠使用標(biāo)準(zhǔn)的CRISPR技術(shù)敲除一個(gè)或多個(gè)基因,并且開(kāi)發(fā)了許多更先進(jìn)的CRISPR技術(shù),能夠以非常低的脫靶突變率進(jìn)行高效的基因編輯。
衍生自誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)的異基因T細(xì)胞的開(kāi)發(fā)也可以提供一種替代方法,通過(guò)允許進(jìn)行多種遺傳改變來(lái)改善CAR-T細(xì)胞的運(yùn)輸和持久性。iPSC將首先使用各種CRISPR引導(dǎo)物進(jìn)行修飾,從而能夠敲低選定的基因,使細(xì)胞具有低免疫原性,然后使用能夠敲低T細(xì)胞功能的選定關(guān)鍵抑制劑的引導(dǎo)物。在選擇具有所有預(yù)期改變的克隆后,可以添加額外的基因來(lái)增強(qiáng)運(yùn)輸或功能。
策略2:短命效應(yīng)細(xì)胞模式
盡管沒(méi)有得到很好的研究,但一些數(shù)據(jù)支持在實(shí)體瘤小鼠模型中使用壽命更短、更像效應(yīng)器T細(xì)胞的優(yōu)越性。例如在對(duì)間皮素靶向CAR-T細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn),具有CD28–CD3ζ胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(更像效應(yīng)器)的細(xì)胞比具有4-1BB–CD3z胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞具有更好的抗腫瘤活性。
鑒于持久性不是目標(biāo),策略2也可能使用mRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)的CAR T細(xì)胞。這種方法的一個(gè)明顯優(yōu)點(diǎn)是對(duì)轉(zhuǎn)基因的大小沒(méi)有限制,可以通過(guò)電穿孔引入一種以上的mRNA并同時(shí)表達(dá),從而能夠引入多種遺傳變異。
然而,使用這種方法制備的mRNA–CAR-T細(xì)胞的一個(gè)潛在限制是,與策略1中的“一次性”方法相比,必須隨時(shí)間給藥多劑量CAR-T細(xì)胞的成本問(wèn)題。盡管患者需要再次輸注,但這與化療或免疫檢查點(diǎn)抑制劑的給藥類(lèi)似,通常每4-6周給藥一次,有時(shí)會(huì)持續(xù)多年。
小結(jié)
解決CAR-T細(xì)胞療法在實(shí)體瘤患者中的應(yīng)用所面臨的眾多挑戰(zhàn)是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。目前的治療方法對(duì)實(shí)體瘤患者基本無(wú)效,其中的原因我們并沒(méi)有完全理解。獲得更多更好的關(guān)于CAR-T細(xì)胞在接受治療的患者中的運(yùn)輸、持久性和功能的信息對(duì)于解決這些方面的問(wèn)題至關(guān)重要。
治療成功的大量障礙可能需要多種免疫逃避機(jī)制的共同靶向。這些策略將包括使用CAR工程的優(yōu)化,在離體T細(xì)胞擴(kuò)增過(guò)程中優(yōu)化條件以促進(jìn)特定T細(xì)胞亞型的出現(xiàn),以及操縱宿主以改變TME或刺激天然T細(xì)胞,可能需要使用所有這些方法來(lái)實(shí)現(xiàn)最佳結(jié)果。
參考文獻(xiàn):
1.CART cell therapy for patients with solid tumours: key lessons to learn andunlearn. Nat Rev Clin Oncol.2023 Oct 30
原文標(biāo)題 : 實(shí)體瘤的CAR-T細(xì)胞治療:關(guān)鍵的經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)
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