前言

近年來，細(xì)胞內(nèi)靶向蛋白降解（iTPD）已成為小分子藥物開發(fā)的一種重要的新模式。第一類稱為蛋白質(zhì)水解靶向嵌合體（PROTACs），通過構(gòu)建雙功能小分子，募集感興趣的藥物靶蛋白（POI）和用于蛋白酶體降解的E3連接酶，通過蛋白酶體降解。第二類被稱為分子膠，分子膠增強(qiáng)了E3連接酶和POI之間的相互作用，導(dǎo)致其泛素化和蛋白酶體降解。

與傳統(tǒng)的抑制劑相比，iTPD具有顯著的優(yōu)勢。首先，PROTAC或分子膠理論上可以結(jié)合POI上的任何地方，而抑制劑通常需要結(jié)合到活性或變構(gòu)位點。其次，靶標(biāo)的降解會去除整個蛋白質(zhì)，包括其支架功能，因此該藥物的治療活性應(yīng)該持續(xù)更長時間，更接近基因敲除實驗的結(jié)果。第三，這些分子以催化作用，而不是像經(jīng)典的藥理學(xué)抑制劑以化學(xué)計量作用，因此較低的劑量可以達(dá)到相同的治療效果。

iTPD的進(jìn)展啟發(fā)了生物學(xué)和化學(xué)界以細(xì)胞外蛋白質(zhì)為靶點，稱之為細(xì)胞外TPD（eTPD）。除了目標(biāo)POI的位置之外，iTPD和eTPD之間至少有三個顯著的區(qū)別。首先，細(xì)胞通過兩個主要途徑回收蛋白質(zhì)：蛋白酶體和溶酶體途徑。iTPD幾乎只通過蛋白酶體途徑，該途徑通常用于處理細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)。eTPD涉及雙特異性生物大分子或小分子，它們將膜結(jié)合或分泌的POI募集到膜結(jié)合循環(huán)受體，并將POI輸送到溶酶體，這是細(xì)胞外蛋白降解的典型途徑。

其次，這兩種蛋白水解破壞模式具有不同的動力學(xué)，并使用不同的蛋白酶。iTPD更快——通常在幾分鐘到幾個小時內(nèi)，因為所有成分都在細(xì)胞內(nèi)。相比之下，eTPD的速度通常較慢，通常在6–48小時，因為它涉及從膜通過早期和晚期內(nèi)體的囊泡運輸，并最終與溶酶體融合導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解。

第三，幾乎所有的iTPD系統(tǒng)都只使用少數(shù)E3連接酶，主要是cereblon（CRBN）或von Hippel–Lindau（VHL），在尋找E3連接酶結(jié)合物方面存在挑戰(zhàn)。這兩種連接酶在組織中廣泛表達(dá)，這限制了組織選擇性靶向。相比之下，eTPD可以使用了多種降解系統(tǒng)，這允許更特異的組織選擇性。最后，與典型的小分子相比，抗體的藥代動力學(xué)非常長，因此給藥頻率較低。因此，eTPD代表了一種新興的生物藥開發(fā)的新模式。

eTPD的優(yōu)勢

對于已有的生物藥模式來說，生物藥領(lǐng)域似乎已經(jīng)有足夠多的選擇，如抗體、抗體偶聯(lián)藥物（ADC）、雙特異性T細(xì)胞結(jié)合器或嵌合抗原受體（CAR）-T細(xì)胞。eTPD不太可能取代殺死癌細(xì)胞的高效方式。然而，已有的模式均有局限性，例如ADC的毒性載荷造成的附帶損害，或誘導(dǎo)CAR-T細(xì)胞的細(xì)胞因子風(fēng)暴，以及生產(chǎn)和給藥挑戰(zhàn)。此外，這些治療方式僅限于膜POI，也主要用于腫瘤學(xué)中急性的危及生命的疾病。

最接近eTPD的比較物是通過功能性阻斷POI發(fā)揮作用的裸抗體。抗體和eTPD都可以作用于可溶性或膜結(jié)合的靶標(biāo)。然而，eTPD可能具有顯著優(yōu)勢。首先，與通過化學(xué)計量結(jié)合阻斷功能的抗體相比，eTPD可以催化降解靶標(biāo)。因此，原則上，eTPD可以減少所需的劑量，當(dāng)POI大量存在時，這可能是一個顯著的優(yōu)勢。其次，eTPD和其他降解機(jī)制不僅可以完全阻斷POI的單個活性位點的功能，還可以完全阻斷整個蛋白質(zhì)的功能，確保任何潛在的功能都被消除。事實上，在eTPD中消除了靶向功能位點，為淀粉樣蛋白等打開了靶表位空間。

另一個可能不太明顯的優(yōu)點是，與長半衰期抗體的隨機(jī)結(jié)合可以產(chǎn)生低水平的毒性POI，尤其是對于可溶性POI。例如，已知治療性抗體貝伐單抗顯著增加可溶性靶標(biāo)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的循環(huán)半衰期。IL-6和其他幾種與細(xì)胞因子或生長因子結(jié)合的抗體也出現(xiàn)了同樣的情況。即使是少量的緩沖效應(yīng)也可能產(chǎn)生矛盾的后果。在一個最早的例子中，人們發(fā)現(xiàn)人類生長激素受體天然脫落的胞外結(jié)構(gòu)域（hGHbp）顯著提高h(yuǎn)GH的半衰期，并能增強(qiáng)hGH活性。因此，與簡單的結(jié)合導(dǎo)致功能阻斷相比，致病POI的eTPD降解可能具有顯著的藥理學(xué)優(yōu)勢。

降解可溶性POI的清除抗體

抗體的Fc區(qū)對抗體回收和免疫細(xì)胞活化具有重要功能。新生兒Fc受體（FcRn）負(fù)責(zé)回收內(nèi)化的抗體，在抗體到達(dá)溶酶體降解之前將其送出細(xì)胞，增強(qiáng)抗體與FcRn的結(jié)合可以將其在人類中的血清半衰期延長。

通過巧妙地設(shè)計，可以使工程化抗體通過FcRn以pH可切換的方式將POI遞送到酸性內(nèi)體，酸性內(nèi)體釋放POI進(jìn)行溶酶體降解。Tocilizumab（Tcz），這是一種被批準(zhǔn)用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的人源化抗體，與IL-6受體（IL-6R）具有pH依賴性結(jié)合。通過將Tcz重新設(shè)計成清除抗體，利用已知的突變提高了其對FcRn的親和力，然后通過CDR的突變在pH6.0的情況下將對IL-6的親和力降低約20倍，同時在pH 7.4保持親和力。修飾的抗體可以將IL-6R輸送到溶酶體，同時保持與FcRn的連接，并循環(huán)回質(zhì)膜以收集更多的IL-6。這將猴子的血清半衰期從1周提高到1個月。

研究表明，pH可切換抗體清除IL-6R所需的劑量比母抗體低20倍，且允許皮下注射，而不需靜脈輸注。pH可切換的Tocilizumab于2020年被批準(zhǔn)用于治療視神經(jīng)脊髓炎譜系障礙，這代表了eTPD中第一個被批準(zhǔn)的抗體。

基于聚糖的循環(huán)受體eTPD

使用聚糖靶向的再循環(huán)受體，如陽離子非依賴性甘露糖6-磷酸受體（CI-M6PR）或去唾液酸糖蛋白受體（ASGPR），可以促進(jìn)膜和可溶性POI的溶酶體降解。一種方法涉及CI-M6PR的多個聚糖配體與靶向POI的抗體的生物偶聯(lián)，稱為溶酶體靶向嵌合體（LYTAC）。LYTAC–POI復(fù)合物與CI-M6PR結(jié)合后被內(nèi)化，導(dǎo)致POI在溶酶體中降解。另一種方法被稱為MoDE或ASGPR靶向嵌合體（ATACs）的雙功能小分子，被用于開發(fā)基于ASGPR的類似方法。

CI-M6PR是一個300 kDa二聚體I型受體，是pH可切換受體，其在中性pH下與配體結(jié)合，并在內(nèi)涵體與溶酶體融合之前在酸性內(nèi)涵體中釋放。CI-M6PR已被用于將攜帶M6P的外源性溶酶體酶穿梭到溶酶體，以治療溶酶體疾病。一項研究將6至8個含有甘露糖6-磷酸酯（M6Pn）的不可水解聚糖隨機(jī)偶聯(lián)到POI靶向抗體的賴氨酸殘基上，以產(chǎn)生潛在的eTPD。研究表明，聚糖標(biāo)記的mCherry或ApoE4抗體可以10到100倍的速率比非特異性對照更快地吸收這些可溶性配體。

ASGPR主要在肝細(xì)胞上高表達(dá)，并可快速清除非唾液酸化糖蛋白。一項研究證明，約10個拷貝的tri-GalNac與POI結(jié)合抗體的生物偶聯(lián)可用于降解各種治療上感興趣的蛋白質(zhì)。HEPG3細(xì)胞中高達(dá)70%的EGFR在24-48小時后被降解、 這與基于CI-M6PR的LYTAC的結(jié)果相當(dāng)。

總之，基于聚糖的eTPD降解方法主要利用ASGPR或CI-M6PR。它們具有非常不同的組織分布；ASGPR在肝臟中高表達(dá)，而CI-M6PR更廣泛地表達(dá)，但主要在免疫細(xì)胞中。事實上，聚糖對降解臂的親和力本質(zhì)上低于抗體，這需要多個糖單元和高水平的偶聯(lián)。這可能在CMC上會有巨大挑戰(zhàn)。但是盡管如此，這兩種基于聚糖的降解系統(tǒng)提供了去除膜和可溶性蛋白質(zhì)的令人興奮的途徑。

基于跨膜E3連接酶靶向膜蛋白的eTPD

E3連接酶除了600–700個細(xì)胞內(nèi)的成員外，還有一個約包含30多個成員的含有跨膜結(jié)構(gòu)域的E3連接酶家族。利用靶向該家族成員和POI的雙特異性抗體可以降解靶蛋白，被稱為AbTACs或PROTAB。該家族中最具特征的成員之一是RNF43，RNF43是一種783殘基的1型蛋白，包含一個200個氨基酸的胞外結(jié)構(gòu)域，隨后是一個跨膜結(jié)構(gòu)域和一個包含E3連接酶RING結(jié)構(gòu)域的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。另一種同源物ZNRF3，具有與RNF43不同的組織分布。

一項研究構(gòu)建了一種PD-L1的AbTAC，POI臂選擇與PD-L1結(jié)合的atezolizumab的Fab結(jié)構(gòu)域，降解臂使用RNF43胞外結(jié)構(gòu)域的Fab。Atz-AbTAC采用了經(jīng)典的KIH模式，Atz AbTAC誘導(dǎo)了PD-L1的降解，DC50為3.4nM，24小時最大降解（Dmax）約為63%，全細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)顯示細(xì)胞蛋白質(zhì)組沒有顯著的總體變化，也沒有顯著的細(xì)胞毒性。

此外，有研究探索與跨膜E3連接酶家族結(jié)合的VHH，包括RNF43和ZNRF3，以及其他三種連接酶，RNF128、RNF130和RNF167，他們稱之為通過E3泛素連接酶募集（REULR）的消除受體。研究發(fā)現(xiàn)，一些含有cetuximab-Fab臂的REULR抑制了A431細(xì)胞中75%的細(xì)胞增殖。一家新的初創(chuàng)公司InDuPro目前專注于REULR技術(shù)。

總之，已有研究表明，與跨膜E3泛素連接酶家族成員（包括RNF43、ZNRF3、RNF128、RNF130和RNF167）的雙特異性分子（AbTACs、PROTABs和REULRs）可以共同選擇降解一些重要的膜蛋白，如EGFR、HER2、IGF1R、PD-L1和PD1，從而達(dá)到治療目的。

基于細(xì)胞因子靶向膜蛋白的eTPD

眾所周知，許多細(xì)胞因子可以通過穿梭到溶酶體而被其受體吸收和降解。這為利用eTPD的內(nèi)源性機(jī)制提供了另一個機(jī)會，方法稱為細(xì)胞因子受體靶向嵌合體（KineTAC）。

這種方法的第一個例子利用了誘餌循環(huán)受體CXCR7，其內(nèi)化其配體CXCL12，而無需下游信號。一項研究利用CXCL12構(gòu)建了atezolizumab-KineTAC，體外試驗顯示，24小時后觀察到PD-L1水平相對于同種型對照降低約70%、48小時后降解率高達(dá)84%。類似的結(jié)果也體現(xiàn)在包含HER2抗體的trastuzumab -KineTAC，在MDA-MB-175VII細(xì)胞上降解HER2在24小時達(dá)到60%。

與AbTAC一樣，KineTAC可以降解多種細(xì)胞類型上的廣泛膜蛋白。而且與LYTAC類似，它們也可以降解可溶性蛋白，因為循環(huán)不依賴于泛素化。KineTAC似乎對降解受體起催化作用，因為研究表明，CXCR7水平在PD-L1或EGFR降解過程中不會改變。此外，POI的轉(zhuǎn)錄水平可以顯著高于降解物，并且仍然可以有效降解。

基于整合素的eTPD

受利用整合素αVβ3靶向遞送抗癌藥物的啟發(fā)，eTPD引入了基于整合素的降解系統(tǒng)。這些細(xì)胞粘附分子作為細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)連接的關(guān)鍵介質(zhì)，通常在癌癥中過表達(dá)�；�于整合素是非常有吸引力的降解系統(tǒng)，因為它們能夠與含有簡單Arg-Gly-Asp（RGD）基序的配體結(jié)合并將其轉(zhuǎn)運到溶酶體。

作為原理證明，使用整合素αVβ3-結(jié)合生物素嵌合體靶向生物素結(jié)合蛋白NeutrAvidin。該分子含有與生物素共價連接的環(huán)狀RGD基序（cRGD），在20 h內(nèi)成功內(nèi)化A549細(xì)胞中的NeutrAvidin。此外，NeutrAvidin的內(nèi)化與Lyso Tracker共定位，并可被溶酶體抑制劑阻斷。BMS-8是一種與PD-L1結(jié)合的小分子，BMS-8 cRGD 嵌合體在異種移植物小鼠模型中，與單獨的BMS-8相比，顯著減少了體重減輕、腫瘤生長和脾臟轉(zhuǎn)移�？傮w而言，這種基于整合素的降解系統(tǒng)為膜或可溶性蛋白的腫瘤選擇性降解顯示了令人興奮的潛力。

從內(nèi)部降解膜蛋白的eTPD

受體酪氨酸激酶（RTK）已有PROTAC靶向的研究，該P(yáng)ROTAC含有與各種RTK抑制劑連接的CRBN或VHL的經(jīng)典E3連接酶結(jié)合物。C4Therapeutics還開發(fā)了一種EGFR小分子降解劑（L858R）CFT8919，該藥物已獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）的研究新藥批準(zhǔn)。

與單獨的抑制相比，受體的降解顯示出幾個優(yōu)點。與對照相比，PROTAC對MET在降低細(xì)胞活力方面更有效，并且在沖洗后反應(yīng)持續(xù)，表明反應(yīng)持久。此外，降解誘導(dǎo)了較少的激酶重新布線，這是RTKs經(jīng)典抑制劑的常見抗性機(jī)制。降解機(jī)制被證明是完全依賴于蛋白酶體的，并且出乎意料地不依賴于網(wǎng)格蛋白。

總之，研究表明，使用與VHL或CRBN結(jié)合的PROTAC可以從內(nèi)部降解RTK。降解動力學(xué)比其他PROTAC稍慢，就IC50值而言，PROTAC化合物的效力不如生物制劑，并且似乎受到進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)連接酶所需的細(xì)胞滲透的顯著限制。盡管仍處于初級階段，但使用靶向膜蛋白細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的PROTAC已顯示出應(yīng)用潛力。

小結(jié)

eTPD領(lǐng)域尚處于起步階段，仍有許多重要問題需要解決。eTPD在哪些靶標(biāo)方面具有明顯優(yōu)勢？最重要的POI是什么？在哪些治療領(lǐng)域？這些對慢性病或急性病更有用嗎？eTPD主要針對可溶性或膜POI，還是同時針對兩者？安全有效的eTPD藥物的組織選擇性有多重要？ eTPD將形成什么類型的耐藥性機(jī)制，與其他藥物模式相比，對eTPD藥物的耐藥性是否更可能出現(xiàn)？這些問題亟待解答。

在某些方面，eTPD讓人想起飛機(jī)的發(fā)展過程。早期人們設(shè)計了許多巧妙的飛行器，包括人形或電動的鳥類裝置，以及多翼和固定翼飛機(jī)。盡管存活下來的設(shè)計很少，但多樣性對于推進(jìn)技術(shù)并最終實現(xiàn)成功設(shè)計的廣泛商業(yè)化至關(guān)重要。對于eTPD領(lǐng)域來說，這是一個激動人心的時刻，預(yù)計未來還會有更多的發(fā)現(xiàn)。

參考文獻(xiàn)：

1.Extracellulartargeted protein degradation: an emerging modality for drug discovery. Nat RevDrug Discov.2023 Dec 7

       原文標(biāo)題 : 細(xì)胞外靶向蛋白降解：藥物發(fā)現(xiàn)的新模式