侵權(quán)投訴
訂閱
糾錯(cuò)
加入自媒體

高效CRISPR-Cas9介導(dǎo)酵母多重基因組編輯

文章背景簡(jiǎn)介

耐熱的漢遜酵母Ogataea polymorpha是一種具有基礎(chǔ)研究和應(yīng)用價(jià)值的微生物。它已成為研究甲醇利用、細(xì)胞自噬、硝酸同化的重要有機(jī)體。它的一個(gè)吸引人的特性是能夠通過(guò)非同源末端連接(NHEJ)將多達(dá)100個(gè)目標(biāo)拷貝基因整合到基因組中。此外,它可以利用人體低聚糖合成糖蛋白,還可以在高達(dá)50℃的溫度下生長(zhǎng),從而可降低工業(yè)發(fā)酵昂貴的冷卻成本。

CRISPER-Cas9輔助基因組編輯技術(shù)的研究進(jìn)展為建立多重基因組工程提供了一種有效的途徑。其基本原理是:反式激活crRNA:crRN雙鏈直接引導(dǎo)Cas9蛋白與目標(biāo)DNA序列結(jié)合,然后Cas9蛋白在PAM上游的三個(gè)核苷酸中產(chǎn)生雙鏈斷裂(DSB)。DSB可以通過(guò)非同源末端連接插入或修復(fù),也可以通過(guò)同源重組來(lái)進(jìn)行精準(zhǔn)編輯,如基因敲除,點(diǎn)突變等。

核糖體DNA(rDNA)是編碼核糖體RNA的DNA序列。在酵母中,rDNA通常由大量的相同重復(fù)序列組成。在O. polymorpha中,rDNA包含50-60個(gè)8kb的重復(fù)單元。在釀酒酵母(S. cerevisiae)中,rDNA位點(diǎn)由150-200個(gè)重復(fù)序列組成,重復(fù)序列為9.1kb。近年來(lái),rDNA重復(fù)序列已成為一些酵母菌多拷貝基因整合的目標(biāo)位點(diǎn)。

2018年6月,中國(guó)科學(xué)院微生物學(xué)研究所病原微生物學(xué)與免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的Laiyou Wang等人,在《Biotechnology for Biofuels》雜志(IF2018=5.497;工程技術(shù) 1區(qū))發(fā)表了題為“Efficient CRISPR-Cas9 mediated multiplex genome editing in yeasts”的文章。

所用到的主要方法

1.活細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化

2.質(zhì)粒構(gòu)建和模板編輯

3.編輯效率計(jì)算:

編輯效率=所需突變體數(shù)目/總被測(cè)菌落數(shù)

4.流式細(xì)胞儀分析

5.基因拷貝數(shù)估計(jì)

6.穩(wěn)定性檢測(cè)

7.搖瓶發(fā)酵

8.產(chǎn)品濃度分析:HPLC

文章主要內(nèi)容摘要

在本研究中,作者發(fā)展了一種CRISPR-Cas9輔助多重基因組編輯(CRISPR–Cas9-assisted multiplex genome editing,CMGE)方法,包括多重基因敲除、多位點(diǎn)(ML)和多拷貝(MC)整合方法。在CMGE的基礎(chǔ)上,對(duì)漢遜酵母(O.polymorpha)進(jìn)行了基因敲除、整合和精確點(diǎn)突變等基因組修飾。采用CMGE-ML整合方法,在白藜蘆醇生物合成途徑三個(gè)不同的位點(diǎn)同時(shí)整合 橙色滑柱菌(Herpetosiphon aurantiacus)的酪氨酸解氨酶(TAL)基因,擬南芥的4-香豆酰CoA連接酶(4CL)基因和釀酒葡萄的芪合酶(STS)基因,成功實(shí)現(xiàn)白藜蘆醇在O. polymorpha內(nèi)的生物合成。采用CMGE-MC方法,將不同拷貝數(shù)的融合基因表達(dá)盒Psctef1-TAL-Psctpi1-4CL-Psctef2-STS整合到基因組中,白藜蘆醇產(chǎn)量比單拷貝整合提高了20倍,達(dá)到97.23±4.84 mg/L。此外,本研究還利用CMGE-MC技術(shù)分別整合了人血清白蛋白(HSA)和大腸桿菌賴氨酸脫羧酶(cadA)基因,實(shí)現(xiàn)了人血清白蛋白和尸胺的生物合成。除漢遜酵母外,本研究還在釀酒酵母內(nèi)也成功地建立了 CMGE-MC方法。CMGE方法為O. polymorpha和其他酵母的基因工程和合成生物學(xué)研究提供了一個(gè)有效的工具。

在釀酒酵母中同步敲除多基因的CRISPR-Cas系統(tǒng)

聲明: 本文由入駐維科號(hào)的作者撰寫(xiě),觀點(diǎn)僅代表作者本人,不代表OFweek立場(chǎng)。如有侵權(quán)或其他問(wèn)題,請(qǐng)聯(lián)系舉報(bào)。

發(fā)表評(píng)論

0條評(píng)論,0人參與

請(qǐng)輸入評(píng)論內(nèi)容...

請(qǐng)輸入評(píng)論/評(píng)論長(zhǎng)度6~500個(gè)字

您提交的評(píng)論過(guò)于頻繁,請(qǐng)輸入驗(yàn)證碼繼續(xù)

  • 看不清,點(diǎn)擊換一張  刷新

暫無(wú)評(píng)論

暫無(wú)評(píng)論

醫(yī)療科技 獵頭職位 更多
文章糾錯(cuò)
x
*文字標(biāo)題:
*糾錯(cuò)內(nèi)容:
聯(lián)系郵箱:
*驗(yàn) 證 碼:

粵公網(wǎng)安備 44030502002758號(hào)