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文章背景簡介

BACKGROUND INTRODUCTION

雙鏈斷裂（DSBs）是一種嚴(yán)重的染色體損傷，可導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定。真核細(xì)胞主要通過同源重組（HR）和非同源末端連接（NHEJ）兩種機(jī)制來修復(fù)DSBs。從酵母到人類，每一種都是高度保守的。HR需要一個同源模板來實現(xiàn)修復(fù)，而NHEJ則執(zhí)行兩個DSB端直接連接。通常來說，相同的DSB末端連接在一起我們稱之為順式修復(fù)（cis）；兩個不同的DSB末端異常連接在一起，我們稱之為反式修復(fù)（trans）。反式修復(fù)會導(dǎo)致染色體的重排，包括易位、倒轉(zhuǎn)、缺失、插入和重復(fù)。對大多數(shù)自發(fā)重排的聯(lián)合分析揭示了連接處的微同源性，表明它們通常是NHEJ的結(jié)果。然而，阻止或促進(jìn)具有多個DSB的細(xì)胞核中反式重排的因素卻知之甚少。

重要的是，順式和反式修復(fù)在DSBs都代表真正的DNA修復(fù)。因此，類似依賴rad52的機(jī)制可以同時進(jìn)行同源重組和異位重組。依賴于Ku家族 DSB結(jié)合蛋白和DNA連接酶IV（酵母中的Dnl4）的共同機(jī)制可以催化順式和反式NHEJ事件。依賴于DSB的誘變可能取決于細(xì)胞核中病變的空間分布，特別是不同位置的DSB是否同樣可能使其末端連接。Lisby等研究表明，在形成多個DSB后，在釀酒酵母中僅觀察到兩個Rad52病灶，表明每個病灶都聚集了不止一個DSB進(jìn)行修復(fù)。 這說明DSB傾向于聚集，即聚集在一起進(jìn)行修復(fù)。 在內(nèi)切核酸酶誘導(dǎo)后或在將細(xì)胞暴露于電離輻射后，哺乳動物細(xì)胞中也報道了DSB的聚類。 有人認(rèn)為DSB聚類是有利的，并不局限于接近的染色體結(jié)構(gòu)域，因此空間臨近性不足以解釋DSB聚類。

美國密歇根大學(xué)的Sham Sunder和Thomas E．Wilson，2019年在《Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America》（IF 9．504，生物2區(qū)）發(fā)表題為“Frequency of DNA end joining in trans is not determined by the predamage spatial proximity of double－strand breaks in yeast”的研究。在這項工作中，作者們研究了同源DSB在酵母細(xì)胞核中的相對位置如何影響反式DSB修復(fù)頻率。 本研究主要專注于精確的NHEJ以及類似MMEJ的SSA（single strand annealing）事件。 在形成多個DSB之后，順式修復(fù)優(yōu)于反式修復(fù)，但反式修復(fù)效率與所報道的核內(nèi)DSB位點的預(yù)損傷空間鄰近性顯著無關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)與DSB的固定化和可能的區(qū)域化修復(fù)是一致的。這些發(fā)現(xiàn)與DSB被聚集并可能被分割以進(jìn)行修復(fù)是一致的。

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所用到的主要方法

METHODS

1．基因組重排測定NHEJ、SSA和HR修復(fù)實驗。

2．競爭實驗

3．接觸頻率的計算

4． DSB修復(fù)結(jié)果分析

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文章主要內(nèi)容摘要

ABSTRACT

DNA雙鏈斷裂（DSBs）是嚴(yán)重的基因組損傷，如果錯誤修復(fù)會導(dǎo)致染色體的重排。為了深入了解促成這些重排的核機(jī)制，本研究在酵母中開發(fā)了一種對于大多數(shù)精密的非同源末端連接（NHEJ）的測定修復(fù)的方法，包括順式（相同位點）和反式（不同位點）的修復(fù)。在測定中，HO內(nèi)切酶基因置于兩個HO切割位點之間，這樣在誘導(dǎo)HO內(nèi)切酶表達(dá)后可以自我終止。進(jìn)一步在不同的基因組位點上放置了一個額外的剪切位點，這樣反式修復(fù)可導(dǎo)致LEU2報告基因的表達(dá)。與之前的研究一致，順式NHEJ比反式NHEJ更有效。然而，與同源重組不同，單個DSB與供體基因座之間的空間距離與修復(fù)效率相關(guān)；而無論兩個DSB基因座的位置如何，即使當(dāng)兩個反式修復(fù)具有競爭關(guān)系時，反式NHEJ頻率基本保持不變。通過短的直接重復(fù)序列經(jīng)單鏈退火修復(fù)（SSA）類似的DSBs，修復(fù)效率和反式修復(fù)頻率都顯著提高，但仍然沒有反式修復(fù)與基因組位置的強(qiáng)相關(guān)性。本研究結(jié)果表明多個DSB修復(fù)不受預(yù)損傷空間臨近性的影響。

▼相關(guān)鏈接▼高效修復(fù)DNA雙鏈斷裂需要瞬時RNA－DNA雜交體的形成