大家好,今天菠蘿冰給大家分享一篇22+分的學(xué)習(xí)筆記。

題目:病毒驅(qū)動型和致癌物驅(qū)動突變型頭頸癌的免疫狀況。

一、 分析思路

我們給?家簡單解讀?下分析思路:本篇學(xué)習(xí)筆記中通過單細(xì)胞RNA測序分析和多光譜免疫熒光(IF)比較了突變驅(qū)動型和病毒驅(qū)動型(HPV+)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌HNSCC的免疫狀況,并研究了腫瘤中的空間定位模式和微環(huán)境(TME)中細(xì)胞鄰近關(guān)系。為HPV +和HPV-HNSCC中的免疫譜系,細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)和分化軌跡以及與腫瘤進(jìn)展?jié)撛谙嚓P(guān)的細(xì)胞交互提供了深入了解。最后,還確定了在臨床中具有預(yù)后潛力的基因集。

二、 結(jié)果解讀

1．HNSCC免疫譜系的單細(xì)胞研究

首先,測序完成得到基因/barcode矩陣后,經(jīng)過質(zhì)量控制,一共評估了HPV–和HPV + HNSCC患者以及健康供體的外周和腫瘤內(nèi)免疫細(xì)胞中131,224個單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜。

實驗組:術(shù)后未接受免疫治療的HPV–患者(n=18)、HPV + HNSCC患者(n=8)的原發(fā)腫瘤中成對血液和組織來源的所有活細(xì)胞(即CD45 +PBMC、CD45 +TIL)(圖1A);對照組:健康供體的外周血單核細(xì)胞(n=6)、健康供體的扁桃體組織(tonsil,n=5)。

接著,根據(jù)單細(xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)行偽bulk分析(Pseudobulk analysis),即通過計算細(xì)胞的基因總計數(shù),生成每個樣本的偽表達(dá)譜,以形成每個患者的表達(dá)矩陣。鑒定出PBMC,TIL和tonsil之間的差異表達(dá)基因后,使用R包heatmap3可視化得到樣本間相關(guān)性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)相較正常和腫瘤PBMC,組織層面的TIL和tonsil的差異更大,所以接下來聚焦于比較TIL和tonsil。鑒定出TIL和tonsil之間差異表達(dá)基因后,還進(jìn)行了事后功效分析(post hoc power analysis)評估現(xiàn)有研究的統(tǒng)計能力,發(fā)現(xiàn)需要9名患者才能有80%的能力找到兩者的差異表達(dá)的基因。

在進(jìn)行文庫大小歸一化,控制線粒體和核糖體基因,對高度變異基因進(jìn)行scale和主成分分析后,使用了兩種方法降維。第一種是FItSNE,主要用于區(qū)分亞群;第二種方法是擴散映射,主要用于進(jìn)行偽時間分析。接下來,使用DRAGON算法進(jìn)行聚類。圖1C為DRAGON確定的26個亞群FItSNE可視化結(jié)果。

FItSNE(https://github．com/KlugerLab/FIt-SNE):大大加快了計算時間,但其旨在檢測離散的亞群,因此通常無法保留分化數(shù)據(jù)的連續(xù)軌跡。

擴散映射(Diffusion map embedding):能更好地保留全局結(jié)構(gòu)和偽時間序列。

DRAGON:(https://github．com/arc85/dragonsc):結(jié)合了高斯混合模型和確定性退火聚類。不同于K均值聚類需要找類中心,高斯混合模型利用的是均值和標(biāo)準(zhǔn)差變化計算各變量的聯(lián)系;確定性退火則是把細(xì)胞聚類最優(yōu)化問題看作系統(tǒng)自由能最小化問題。

接下來采取的細(xì)胞注釋策略是先分大類→再分小類。因為在高的溫度下,想得到自由能最小,cluster之間的差別要很大,所以他先在較高的T值聚類出四類亞群:CD4 +T,B,細(xì)胞毒性細(xì)胞(CD8 + T和NK)和髓系細(xì)胞。然后根據(jù)已有的基因表達(dá)模式來細(xì)分細(xì)胞類型(圖1D),并通過流式細(xì)胞術(shù)驗證。還進(jìn)行了第二次事后功效分析,驗證細(xì)胞聚類的可靠性。圖1E顯示了不同樣本來源的細(xì)胞情況。

為了量化HPV–和HPV + TILs主要免疫譜系的差異,使用巴氏距離(Bhattacharyya)(圖1F)衡量了它們之間的差異。結(jié)果顯示HPV–和HPV + TIL之間的B細(xì)胞,髓樣細(xì)胞和CD4 +Tconv細(xì)胞之間存在較大差異。相反,CD8 + T細(xì)胞和CD4 +Treg細(xì)胞較相似。

圖1． 評估患者之間轉(zhuǎn)錄特征的總體變化以及總體聚集和單細(xì)胞鑒定