2．CD8 + T細(xì)胞具有連續(xù)分化軌跡

接下來對CD8 + T細(xì)胞進(jìn)行了生物信息學(xué)分離并重新聚類,得到了8個亞群(圖2A)。TIL的CD8 + T最常見于#1-4,而PBMC和tonsil的CD8 + T細(xì)胞常見于#5-8(圖2B)。圖2C為每個亞群的差異基因。

圖2C得:#1與細(xì)胞周期細(xì)胞(eg． MKI67)相關(guān);#2與干擾素應(yīng)答基因(eg． ISG15)相關(guān);#3和4與檢查點標(biāo)記(eg． PDCD1,CTLA4和HAVCR2)相關(guān);#5表達(dá)較為靜止;#6與幼稚或記憶細(xì)胞(eg． CCR7和CD27)有關(guān);#7與早期激活相關(guān)(eg． JUNB和FOSB);#8表達(dá)與效應(yīng)功能有關(guān)(例如,KLRG1和GZMH)。

接下來,使用自主開發(fā)的新R包SingleSeqGset(https://github．com/arc85/singleseqgset)中進(jìn)行競爭性基因集富集測試(competitive gene set enrichment test),評估了亞群的生物學(xué)功能。其中,#4缺氧反應(yīng)有富集,而先前已經(jīng)證實缺氧誘導(dǎo)因子可增強(qiáng)CD8 + T細(xì)胞效應(yīng),這表明該亞群抗腫瘤活性更高。

接下來,使用R包Destiny進(jìn)行擴(kuò)散映射分析(diffusion map analysis)來推斷分化軌跡。結(jié)果顯示出一條無分叉平滑軌跡(圖2E),HPV +和HPV- TIL也有重疊(圖2F)。因為DC1與抑制性受體表達(dá)以及腺苷代謝增強(qiáng)有關(guān),所以認(rèn)為DC1與終末分化表型密切相關(guān) 。總的來說,這個部分鑒定出CD8 + T各亞群功能,并根據(jù)HPV +和HPV-之間共有的分化軌跡,推斷針對CD8 + T細(xì)胞的免疫治療策略可能均適用于兩種HNSCC。

圖2．CD8 +T的HPV–和HPV + TIL分化軌跡以及抑制性受體的共表達(dá)

3．CD4 + Tconv的異質(zhì)性和分化軌跡

接下來比較了HPV–和HPV + HNSCC之間CD4 + T細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄情況,分別分析了CD4 + Tconv細(xì)胞和CD4 + Treg細(xì)胞。CD4 + Tconv細(xì)胞聚類出7個不同的亞群(圖3AB),#1和6大部分由HPV + TIL和tonsil組成,HPV– TILs則分布在#4和7之間�；�因富集發(fā)現(xiàn)tonsil和TIL中的CD4 + Tconv細(xì)胞顯示出T濾泡輔助功能(TFH)和1型輔助功能(TH1)的富集,且HPV +與HPV– TIL相比,具有顯著的細(xì)胞富集,說明HPV + T細(xì)胞的效應(yīng)功能更強(qiáng)。

圖3C為CD4 + Tconv細(xì)胞的分化軌跡,不同于CD8 + T細(xì)胞,擴(kuò)散圖的前3維產(chǎn)生了分支軌跡(圖3C),且發(fā)現(xiàn)HPV–和HPV + TIL的分化平面顯著不同(圖4D)。接下來將擴(kuò)散擬時間(pseudotime,DPT)作為第三維與DC1,DC2一起分析,DC1和DC2都與DPT正相關(guān)。與基因集富集分析一致,#2是最幼稚的亞群,然后通過連續(xù)的中間表型,向#1或#7終態(tài)發(fā)展。圖3E顯示了#1和7的差異基因表達(dá),#1與TFH有關(guān),#7與記憶性功能有關(guān)。CXCR5和PDCD1與DC1的表達(dá)有關(guān),還發(fā)現(xiàn)了其他已知抑制性受體(LAG3和HAVCR2)在CXCR5和PDCD1共表達(dá)時明顯表達(dá)。這表明了早期階段的命運(yùn)決定模式,過程中細(xì)胞可以發(fā)展為CD4 + TFH或者通過抑制受體共表達(dá),從而潛在地抑制進(jìn)一步分化。

圖3．A-E CD4+ Tconv的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)和分化軌跡的分析

4．CD4 + Treg細(xì)胞中與IFN和TNFR相關(guān)的信號

CD4+ Treg細(xì)胞能抑制抗腫瘤免疫反應(yīng),其細(xì)胞聚類發(fā)現(xiàn)了6個亞群(圖3FG),主要由TIL細(xì)胞構(gòu)成。接下來,進(jìn)行了基因集富集分析,以表征每個亞群的生物活動(圖3H)。#2和4與IFNα應(yīng)答相關(guān),#3和6與TNFR家族信號通路相關(guān),表明這些細(xì)胞根據(jù)其分化狀態(tài)對不同的信號作出反應(yīng)。

CD4 + Treg細(xì)胞的擴(kuò)散映射圖顯示DPT與DC1密切相關(guān)(圖3I)。沿著DC1軸,HPV–與HPV + TIL Treg細(xì)胞的密度存在細(xì)微差異,在早期DPT處,來自HPV– TIL的Treg細(xì)胞更多(圖3J)。

然后還發(fā)現(xiàn)TNFR與DC1正相關(guān),并在晚期DPT表達(dá)。相反,IFN反應(yīng)基因IFITM1,IFIT1,IFIT3和ISG20在早期DPT時表達(dá),并隨著偽時間的進(jìn)展而靜止,表明IFN信號在Treg細(xì)胞的早期活化中具有潛在作用。綜上所述,該分析表明,Treg細(xì)胞在HPV–和HPV + HNSCC之間具有相似的軌跡,并且在分化過程中IFN相關(guān)信號和TNFR家族信號相關(guān),提示靶向Treg細(xì)胞的早期激活過程可以使用基于IFN的治療,而晚期激活的Treg細(xì)胞可能對TNFR介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)更敏感。

圖3．F-J CD4+ Treg細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)和分化軌跡的分析