2．TIL、淋系和髓系評分相關的免疫細胞

MCP－counter是一種通過量化RNA測序結果來評估腫瘤中8個主要免疫細胞和2個基質(zhì)細胞群體豐度的方法。對上述細胞對應的10個變量與TIL、淋系和髓系評分的相關分析發(fā)現(xiàn)：除中性粒細胞以外，MCP－counter包含的所有免疫相關變量與TIL評分、淋系評分和髓系評分之間都有很強的相關性，而成纖維細胞和內(nèi)皮細胞與上述三種評分之間則未發(fā)現(xiàn)相關（圖2A）。

接下來，進一步評估了TIL評分對淋系和髓系細胞在瘤床中豐度的代表能力。具體方式是運用LASSO模型從MCP－counter的10個變量中選擇最佳的能夠預測TIL評分的變量。結果顯示在各種癌癥類型中，平均需要7個（范圍為5－10，圖2B）MCP－counter的變量來預測TIL，提示TIL能較好地描述腫瘤免疫的情況。為了進一步深入探究，又用上述LASSO模型探究了不同癌癥類型中預測淋系和髓系評分所使用的MCP－counter中的變量情況（圖2C，D）。

在上述結果中，可以發(fā)現(xiàn)，在大多數(shù)癌癥類型中，預測TIL評分最重要的兩個變量是T淋巴細胞和單核細胞，而對于淋系評分的預測，最重要的變量是T細胞和B細胞，還有重要性稍低的NK細胞和細胞毒性淋巴細胞；對于髓系評分則是單核細胞，這一發(fā)現(xiàn)表明TIL評分可以較好地代表TCGA泛癌隊列中T淋巴細胞和單核細胞豐度，而淋系評分可以代表T細胞、B細胞以及較低程度上代表NK細胞豐度，髓系評分則是單核細胞豐度的良好指標。

圖2A．TIL、淋系和髓系評分與MCP－counter中10個變量的相關分析；圖2B，C，D．使用LASSO模型基于MCP－counter預測TIL、淋系和髓系評分時使用的變量情況

3．TIL signature在泛癌TCGA隊列中的預后評估

接下來，對TIL評分以及淋系和髓系評分在TCGA泛癌隊列中預測預后的能力進行評估，將它們與兩個作為黑色素瘤免疫檢查點阻斷療效預測的signature——IMPRES和IPS進行了比較。IMPRES包括15對免疫檢查點基因，IPS則是效應細胞，抑制細胞，主要組織相容性復合體（MHC）相關分子，檢查點／免疫調(diào)制劑四個評分的總和。將TIL、淋系和髓系評分視為連續(xù)變量，通過單變量Cox模型評估了這些變量預測總生存期（OS）和無進展間隔（PFI）的能力（圖3A，B）。以對OS的預測作為參考基準，TIL、淋系和髓系評分與IPS和IMPRES評分對預后的預測能力以及預測結果都較為相似，但前三種評分對頭頸部鱗狀細胞癌以及微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)的結腸癌具有顯著的更好的預測性能。以對PFI的預測作為參考基準分析也觀察到了類似的結果。上述結果表明TIL，淋系和髓系三種評分可以提供與IMPRES和IPS相同以及互補的預后信息。

下一步，將TIL，淋系和髓系評分與IMPRES和IPS預測OS和PFI的時間依賴性ROC曲線的AUC進行了比較，發(fā)現(xiàn)TIL、淋系和髓系評分的AUC非常接近，但在預測9種癌癥的OS以及10種癌癥的PFI時，它們的表現(xiàn)優(yōu)于IMPRES和IPS（圖3C，D）。為進一步探討TIL對腫瘤預后預測的貢獻，首先構建包含年齡、性別、腫瘤類型和腫瘤分期的Cox模型，隨后又將基于基因signature的TIL評分和基于HE染色評估的TIL評分添加到模型中。以OS作為比較基準，發(fā)現(xiàn)基于基因signature的TIL評分在9種癌癥類型中提高了預后預測的準確性，而基于HE染色的TIL評分沒有提高模型的精度。在類似的分析中，可發(fā)現(xiàn)淋系評分在6種癌癥類型中提高了預后預測的準確性，而基于HE染色的TIL評分依然沒有類似效果。這些數(shù)據(jù)共同說明TIL評分是TCGA泛癌隊列中與OS和PFI相關的一個強有力的預后預測指標，而且提示免疫腫瘤微環(huán)境的整體評估對患者的預后預測有重要作用。

圖3A，B．TIL、淋系和髓系評分以及IMPRES和IPS在不同癌癥類型中與患者預后的關聯(lián)；圖3C，D．TIL、淋系和髓系評分以及IMPRES和IPS預測不同癌癥類型患者預后的性能對比

4．用于預測對抗PD－1／PD－L1或CTLA－4反應的TIL評分的評價

隨后，對TIL、淋系和髓系評分是否可以作為多個癌癥類型的PD－1／PD－L1抑制劑療效的生物標志物進行探究。為此參考了Yarchoan等人的meta分析——文章中總結了在幾個已發(fā)表的臨床試驗中單獨使用PD－1／PD－L1抑制劑的客觀緩解率（ORR）。依據(jù)這些數(shù)據(jù)，評估了多個癌癥類型中TIL、淋系和髓系評分的中位數(shù)與PD－1／PD－L1抑制劑使用后ORR之間的相關性（圖4A－C），觀察到TIL和淋系評分都與PD－1／PD－L1抑制劑使用后ORR有關，淋系評分的相關系數(shù)略高于TIL評分；但髓系評分并未觀察到類似的相關。另外，還對經(jīng)典的生物標志物腫瘤突變負荷（TMB）、擴展免疫signature（EIG）和PD－L1（CD274）表達進行了類似的分析，與預期一致，所有這些變量都與PD－1／PD－L1抑制劑使用后ORR顯著相關。評估了TMB、EIG、PD－L1表達和淋系評分四者之間的相關情況，發(fā)現(xiàn)TMB與EIG，TMB與淋系評分之間都沒有關系，但EIG、PD－L1和淋系評分三者之間存在密切相關（圖4D）。

圖4A，B，C．不同癌癥類型的TIL、淋系和髓系評分與應用抗PD－1／PD－L1療法后ORR的關聯(lián)；圖4D．TMB，ORR，CD274表達，淋系評分和EIG的相關分析

隨后進行了包括TMB、EIG、PD－L1表達和淋系評分這幾個變量的多因素線性回歸，以得到預測ORR的最佳模型（表1）。使用AIC（一個反映統(tǒng)計模型擬合優(yōu)良性的指標）作為參考，建立了TMB＋淋系評分的最佳模型。用ANOVA對單獨使用TMB和使用TMB＋淋系評分的模型進行比較，發(fā)現(xiàn)淋系評分顯著改善了模型的預測性能（p＝0．05）。上述結果提示：單獨使用淋系評分或者淋系評分＋PD－L1表達／TMB的模型有潛力作為簡單而普適的預測免疫檢查點抑制劑的療效的方法。

表1．包含TMB、EIG、PDL1（CD274）表達和淋系評分的多因素線性回歸結果