由于有效載荷、連接子和偶聯(lián)方法的改進(jìn)，抗體偶聯(lián)藥物（ADC）的發(fā)展在過去十年中取得了顯著進(jìn)展。特別是，連接子設(shè)計(jì)在調(diào)節(jié)ADC在體循環(huán)中的穩(wěn)定性和腫瘤中的有效載荷釋放效率方面起著關(guān)鍵作用，從而影響ADC的藥代動力學(xué)（PK）、療效和毒性特征。

一些關(guān)鍵的連接子參數(shù)，如偶聯(lián)化學(xué)、連接子長度和連接子空間位阻都會對ADC藥物的PK和功效產(chǎn)生影響。因此，在ADC藥物的設(shè)計(jì)中，正確調(diào)整連接子的這些重要參數(shù)，從而實(shí)現(xiàn)ADC穩(wěn)定性和有效載荷釋放效率之間的平衡，才能達(dá)到ADC藥物預(yù)期的效果。

連接子設(shè)計(jì)調(diào)節(jié)ADC穩(wěn)定性

ADC在體循環(huán)和組織細(xì)胞中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，除了抗體代謝和分解代謝外，連接子去偶聯(lián)、連接子降解和有效載荷代謝被認(rèn)為是典型的主要生物轉(zhuǎn)化途徑。

理想情況下，ADC希望在進(jìn)入靶細(xì)胞之前在循環(huán)中保持完整和穩(wěn)定，已經(jīng)開發(fā)出許多涉及偶聯(lián)位點(diǎn)選擇和連接子修飾的方法來增強(qiáng)ADC穩(wěn)定性。通常，可以出于這種目的對每個組件（包括抗體、連接子和有效載荷）進(jìn)行修改，然而研究表明，調(diào)節(jié)偶聯(lián)位點(diǎn)、連接子長度和連接子空間位阻是更有效的通用方法。

通過選擇更具空間位阻的偶聯(lián)或附著位點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)由抗體提供的空間屏蔽。另一方面，已經(jīng)證明，在連接子上引入近端空間位阻的替代化學(xué)修飾是提高穩(wěn)定性的有效方法�？贵w提供的空間屏蔽有助于減少連接子裂解以及有效載荷代謝。例如，位點(diǎn)HC－A118、LC－K149和HC－A140提供了增強(qiáng)的ADC穩(wěn)定性，降低了部分溶劑可及性（FSA），對應(yīng)于偶聯(lián)位點(diǎn)周圍增加的空間屏蔽。

在此基礎(chǔ)上，通過改變另一個主要因素，即連接子長度，可以通過抗體和有效載荷之間的距離對空間屏蔽的影響來調(diào)節(jié)ADC穩(wěn)定性。研究發(fā)現(xiàn)，較短的連接子相對于較長的連接子，通過將有效載荷進(jìn)一步固定在抗體的空間屏蔽內(nèi)，通常會導(dǎo)致更好的ADC穩(wěn)定性。

此外，偶聯(lián)化學(xué)也是影響ADC穩(wěn)定性的重要因素，馬來酰亞胺和二硫鍵代表兩種主要類型的偶聯(lián)化學(xué)。馬來酰亞胺已被廣泛用作抗體偶聯(lián)方式，并與可切割或不可切割的連接子一起使用。因此，根據(jù)有效載荷的作用機(jī)制，藥理有效成分可以是有效載荷本身或具有部分或全長連接子的有效載荷。對于可切割或不可切割的連接子，有效釋放活性成分可以通過最佳連接子設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)�；�于二硫鍵的抗體偶聯(lián)最近被開發(fā)為一種生成可切割連接子的新策略。對于馬來酰亞胺和二硫鍵可裂解的連接子而言，裂解位點(diǎn)附近產(chǎn)生的空間位阻非常關(guān)鍵，可以通過化學(xué)修飾來調(diào)節(jié)偶聯(lián)物的穩(wěn)定性。

連接子設(shè)計(jì)調(diào)節(jié)ADC有效載荷釋放

有效載荷釋放可能是ADC內(nèi)化到細(xì)胞后的限速步驟。對于不可切割的連接子，在溶酶體中，抗體被蛋白酶分解或水解為肽或氨基酸（AA）。在這些情況下，產(chǎn)生生物活性分解代謝產(chǎn)物，其中有效載荷在其結(jié)構(gòu)中保留某種類型的肽或AA，有效載荷溶酶體釋放可能需要一種轉(zhuǎn)運(yùn)體。相反，可切割連接子被設(shè)計(jì)通過酶或化學(xué)方式，在連接基團(tuán)斷裂后自降解，以釋放附著的有效載荷。因此，在這些情況下，有效載荷釋放的速率取決于連接子裂解和隨后的固定步驟。

在相同的連接子化學(xué)條件下，結(jié)合位點(diǎn)會影響有效載荷釋放的動力學(xué)。例如，對于連接到LC－V205、HC－A118、HC－A140和LC－K149位點(diǎn)的連接子，觀察到一系列從快到慢的有效載荷釋放動力學(xué)。特別是，HC－A118C位點(diǎn)的吡咯［2，1－c］苯二氮卓二聚體（PBD）有效載荷釋放（15分鐘）比LC－K149C位點(diǎn)（60分鐘）快。

結(jié)合位點(diǎn)直接影響釋放動力學(xué)，與單克隆抗體無關(guān)。在裂解位點(diǎn)引入空間位阻的化學(xué)修飾有助于提高ADC穩(wěn)定性。此外，空間位阻也可能導(dǎo)致有效載荷的緩慢或無效釋放。一個很好的例子是環(huán)丁基與環(huán)丙基二硫化物連接子之間的比較，環(huán)丁基類似物對小鼠有效，而環(huán)丙基類似物對小鼠無效。深入研究表明，含有環(huán)丁基的分子能夠有效釋放活性PBD二聚體，然而，在環(huán)丙基類似物中未觀察到二硫鍵連接子斷裂后的自降解，因此，有效載荷并沒有得到有效釋放發(fā)揮生物活性。

連接子集成設(shè)計(jì)獲得最佳療效

總體而言，想要獲得最佳的ADC需要集成連接子的設(shè)計(jì)方法。如前所述，這種方法應(yīng)包括多個參數(shù)，包括偶聯(lián)位點(diǎn)、連接子長度、連接子化學(xué)、可切割／不可切割連接和近端連接空間位阻。

如上圖所示，相對穩(wěn)定性排名為A1? A2＜A3? A4 aHER2－ss－PBDTDC。特別是，與S－S二硫鍵兩側(cè)的H相比，CH3增強(qiáng)的空間位阻提高了ADC穩(wěn)定性：A1＜A3（LC－K149C），A2＜A4（HC－A140C）。A4是最穩(wěn)定的PBD－TDC，但在小鼠異種移植模型中，其活性最低。總體療效排名順序?yàn)锳4＜A1＜A3／A2。另一方面，腫瘤中釋放的PBD二聚體濃度的排名與觀察到的療效趨勢大致一致（A4＜A1＜A3＜A2）。

此外，在同一偶聯(lián)位點(diǎn)LC－K149C處，aCD22單甲基auristatin E（MMAE）的TDC穩(wěn)定性在不同的連接子（B1－B3的S－S與B4的馬來酰亞胺）之間相似。然而，當(dāng)B4／B2達(dá)到100％腫瘤生長抑制（TGI）時，觀察到顯著不同的活性（B1＜B3＜B4／B2），同樣與腫瘤內(nèi)釋放的MMAE濃度（B1＜B3＜B4＜B2）一致。

上圖為一系列aCD22 ss maytansine（DMx）TDC，分別在LC－K149C（C1－C6）和S400C（C7－C8）位置對二硫化物連接子進(jìn)行了不同的化學(xué)修飾。療效排名（C3＜C4／C5／C8＜C1／C7／C2／C6），與腫瘤中測得的DMx濃度（C3＜C4／C5／C8＜C1＜C7＜C2＜C6）一致，其中C1／C7／C2／C6達(dá)到100％TGI。因此，最終有效載荷釋放是ADC循環(huán)穩(wěn)定性和有效載荷釋放動力學(xué)的順序累積結(jié)果。

在三組TDC類似物中，盡管腫瘤內(nèi)有效載荷濃度不同，PBD－A3／A2、MMAE－B4／B2、DMx－C1／C7／C2／C6 TDC觀察到完全TGI。與之前的aHER2 MMAE TDC相比，TDC A－C的功效與血漿中的穩(wěn)定性、DAR或總抗體（Tab）暴露無關(guān)�？鼓[瘤療效與腫瘤內(nèi)有效載荷暴露相關(guān)，具有“平臺”效應(yīng)。。因此，以達(dá)到預(yù)期療效所需的最低閾值水平的方式向腫瘤提供有效載荷非常重要。

因此，連接子的設(shè)計(jì)應(yīng)該優(yōu)化，以達(dá)到ADC穩(wěn)定性和有效載荷釋放動力學(xué)之間的平衡，從而在腫瘤細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)有效載荷的釋放高于療效閾值。腫瘤有效載荷濃度評估可用于預(yù)測ADC在臨床前模型中的療效。

連接子集成設(shè)計(jì)結(jié)合劑量方案設(shè)計(jì)

較高的ADC劑量并不總是有助于提高療效，一旦達(dá)到關(guān)鍵閾值，可能只會增加潛在毒性。因此，需要綜合連接子設(shè)計(jì)與劑量方案設(shè)計(jì)，以找到最小有效劑量。

以上圖為例，TDC aHER2－HC－A118C－Me－SS－PBD在靜脈注射1×1mg／kg劑量時達(dá)到完全TGI；而在MMTV－HER2／Fo5小鼠中，超過3周的3×0．33 mg／kg（每周）方案未能達(dá)到完全的腫瘤抑制終點(diǎn)。當(dāng)在BJAB小鼠中測試時，相比3×0．5 mg／kg 的劑量，TDC aCD22－LC－K149C－vc－PAB－MMAE在1×1．5 mg／kg時表現(xiàn)出更好的活性，同樣，在1×3 mg／kg和3×1 mg／kg劑量持續(xù)7周以上時顯示出相似的療效。

另一項(xiàng)試驗(yàn)，TDC aCD22－LC－K149C－MCC－DM1分3個劑量組進(jìn)行，分別采用3種劑量方案：1．5mg／kg總劑量（3×0．5 mg／kg，2×0．7mg／kg，1×1．5 mg／kg），3 mg／kg總劑量（3×1 mg／kg，2×1．5 mg／kg，1×3 mg／kg），6 mg／kg總劑量（2×3 mg／kg，2×3 mg／kg）。盡管所有受試劑量方案均顯示出一定的活性，但較大的每日總劑量組產(chǎn)生了更好的腫瘤抑制作用。此外，在每個劑量組中，單劑量顯示出最佳療效，表明有效載荷Cmax對腫瘤的驅(qū)動效應(yīng)。在這種情況下，當(dāng)達(dá)到完全TGI和比其他相應(yīng)的分?jǐn)?shù)劑量方案更好的腫瘤抑制時，單劑量可作為療效的閾值劑量。在單劑量和多劑量部分方案產(chǎn)生相似療效的情況下，可根據(jù)提供足夠而不過量有效載荷的原則選擇最小有效劑量，以獲得最佳療效曲線和最小毒性。。

小結(jié)

ADC的發(fā)展在過去十年中取得了快速的進(jìn)步，而為了獲得最佳療效的ADC，應(yīng)考慮采用連接子集成設(shè)計(jì)的方法。可采用的重要參數(shù)包括偶聯(lián)位點(diǎn)、偶聯(lián)化學(xué)、連接子長度、可切割／不可切割連接以及局部連接空間位阻。需要解決的關(guān)鍵點(diǎn)是在ADC穩(wěn)定性和有效載荷釋放之間實(shí)現(xiàn)平衡，以獲得最佳的腫瘤內(nèi)有效載荷PK曲線和療效。此外，建議將集成連接子設(shè)計(jì)與劑量設(shè)計(jì)相結(jié)合，以找到理想療效和最小毒性的最佳劑量方案。

參考文獻(xiàn)：

1．Linker Design Impacts Antibody－DrugConjugate Pharmacokinetics and Efficacy via Modulating the Stability and Payload Release Efficiency． Front Pharmacol． 2021； 12： 687926．