前言

斑馬魚（Danio rerio）因其條紋而得名，是一種小型熱帶魚，主要生活在南亞地區(qū)的河流中。40多年前，斑馬魚作為發(fā)育生物學(xué)研究的模式生物進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室。斑馬魚是實(shí)現(xiàn)這一目的的理想選擇，因?yàn)樗鼈兪求w外受精的，可以從一對(duì)繁殖體中生成數(shù)百個(gè)胚胎，并且是透明的，能夠觀察脊椎動(dòng)物從單個(gè)細(xì)胞到器官發(fā)生的全過程。

此外，斑馬魚與人類共享70％的基因組，80％以上的疾病蛋白是保守的。至關(guān)重要的是，斑馬魚模擬的疾病往往代表了真正的人類疾病模型，現(xiàn)在已成為人類疾病強(qiáng)大的研究工具，斑馬魚模型已廣泛用于癌癥、肝病、血液病、心臟病和行為障礙等。

斑馬魚表現(xiàn)藥物篩選優(yōu)勢(shì)

藥物發(fā)現(xiàn)的一個(gè)基本挑戰(zhàn)是顯示療效和了解整個(gè)活體動(dòng)物系統(tǒng)內(nèi)的作用機(jī)制。盡管許多化合物和藥物先導(dǎo)物在體外或細(xì)胞系統(tǒng)中具有活性，但了解藥物在器官、組織和身體遠(yuǎn)端部位的疾病背景下如何發(fā)揮作用至關(guān)重要。斑馬魚模型在這方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

凸顯表型特征

斑馬魚是表型藥物發(fā)現(xiàn)的優(yōu)良模型系統(tǒng)。在表型藥物篩選中，先導(dǎo)藥物是根據(jù)其產(chǎn)生表型結(jié)果的潛力來選擇的，與已知和驗(yàn)證的靶點(diǎn)無關(guān)。表型藥物篩選過程的固有特征包括：即使藥物通過靶向多個(gè)靶點(diǎn)產(chǎn)生預(yù)期的表型結(jié)果，例如激酶抑制劑可以通過靶向多個(gè)激酶產(chǎn)生治療益處，也可以識(shí)別藥物或先導(dǎo)藥物；有可能產(chǎn)生廣泛的表型結(jié)果；針對(duì)化合物的反篩選可用于了解其他毒性或不想要的表型。

斑馬魚胚胎的小尺寸意味著可以在活動(dòng)物中篩選數(shù)千個(gè)胚胎的表型效應(yīng)。雖然表型斑馬魚篩選的通量不如細(xì)胞培養(yǎng)、酵母、果蠅或體外活性測(cè)定中的高，但斑馬魚胚胎的篩選規(guī)模超過了目前可用的其他脊椎動(dòng)物系統(tǒng)。

此外，對(duì)于一些藥物，斑馬魚比小鼠模型更好地再現(xiàn)了在人類身上看到的效果。沙利度胺就是這種情況。在小鼠中，沙利度胺沒有引起任何缺陷；然而，在斑馬魚中，沙利度胺會(huì)導(dǎo)致與人類相同的肢體形態(tài)缺陷。

體現(xiàn)整合的生理學(xué)

斑馬魚幾乎具有與人類相同的組織發(fā)育和穩(wěn)態(tài)，包括血液、肌肉、心臟、肝臟、胰腺、脾臟、腸道、腎臟、骨骼、脂肪以及神經(jīng)元和神經(jīng)嵴的發(fā)育�？梢院Y選藥物在組織中的靶向活性，同時(shí)提供有關(guān)化合物吸收、分布、代謝、排泄和毒性特性的信息。

這種優(yōu)勢(shì)提供了有關(guān)藥物或藥物組合常見副作用的重要信息。例如，阿霉素是一種拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑，對(duì)殺死癌細(xì)胞非常有效，但具有心臟毒性和心力衰竭的巨大風(fēng)險(xiǎn)；在用這種藥物治療的斑馬魚身上也觀察到了同樣的心臟毒性。通過篩選能夠預(yù)防阿霉素誘導(dǎo)的心肌病的輔助療法，發(fā)現(xiàn)了天然產(chǎn)物visnagin，它可以在不改變阿霉素對(duì)癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性的情況下預(yù)防心肌病。

最近，這種整合生理學(xué)的潛力得到了進(jìn)一步開發(fā)，使用斑馬魚來識(shí)別能夠抵抗順鉑劑量限制毒性的化合物，順鉑是一種常見的廣譜化療藥物，可導(dǎo)致腎損傷和耳聾。通過對(duì)腎臟和側(cè)線細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行毒性篩選試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)多巴胺及其相關(guān)調(diào)節(jié)因子具有耳和腎保護(hù)作用，而不影響順鉑誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡的效力。

篩選試驗(yàn)

斑馬魚篩選試驗(yàn)?zāi)軌蛞詥渭?xì)胞分辨率對(duì)器官和組織上的藥物活性進(jìn)行深度表型分析。廣泛的篩選使用了捕捉發(fā)育生物學(xué)、細(xì)胞增殖、癌癥、感染和免疫、行為和毒性等動(dòng)態(tài)的分析。

篩選可以使用抗體（例如磷酸組蛋白H3抗體）在發(fā)育中胚胎的單細(xì)胞水平上跟蹤蛋白質(zhì)表達(dá)，或者固定組織上使用原位雜交跟蹤單個(gè)細(xì)胞中的基因表達(dá)。此外，還可以利用斑馬魚從干細(xì)胞群中再生組織的顯著能力，包括毛細(xì)胞、色素細(xì)胞、骨骼和脊髓的再生。也可以在藥物篩選中使用活胚胎中的熒光報(bào)告系統(tǒng)檢查單個(gè)細(xì)胞和組織。例如，使用熒光報(bào)告基因篩選胰腺β細(xì)胞的調(diào)節(jié)因子，發(fā)現(xiàn)了一組組組蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制劑，即使在高血糖的情況下，也可以降低斑馬魚的血糖水平，并且這些抑制劑在小鼠和人類β細(xì)胞模型中具有保守的功能。

斑馬魚模型與人類疾病

斑馬魚模型為許多人類疾病的基礎(chǔ)研究和藥物研究提供了重要的見解，許多被發(fā)現(xiàn)在斑馬魚體內(nèi)具有拯救疾病活性的小分子已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)。

耳毒性

與耳聾相關(guān)的先天性Usher綜合征已使用斑馬魚精確建模。斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞與哺乳動(dòng)物內(nèi)耳毛細(xì)胞的功能相似，已用于篩選預(yù)防氨基糖苷類抗生素的耳毒性藥物。ORC－13661是通過斑馬魚模型篩選出的先導(dǎo)藥物，ORC－13661通過高親和力阻斷外毛細(xì)胞中的機(jī)械電傳導(dǎo)通道，從而保護(hù)毛細(xì)胞免受氨基糖苷類藥物和順鉑誘導(dǎo)的耳毒性。

ORC－13661的第一階段雙盲安慰劑對(duì)照研究于2019年完成，其耐受性良好。與安慰劑組相比，無嚴(yán)重的治療相關(guān)的不良反應(yīng)，效力呈現(xiàn)劑量相關(guān)性�；�于這些結(jié)果，不久將開始一項(xiàng)二期研究，以評(píng)估ORC－13661是否可以保護(hù)囊性纖維化患者的聽力損失。另一組可能受益于ORC－13661的患者是非結(jié)核分枝桿菌感染患者，他們經(jīng)常使用氨基糖苷類抗生素治療，這可能會(huì)導(dǎo)致聽力損失。

干細(xì)胞移植

在斑馬魚發(fā)育中的主動(dòng)脈中尋找造血干細(xì)胞誘導(dǎo)物的化學(xué)篩選表明，PGE2可以直接刺激造血干細(xì)胞的產(chǎn)生和植入。這一原理也在小鼠骨髓移植中得到了證實(shí)。

隨后在一期臨床試驗(yàn)中測(cè)試了PGE2，在該試驗(yàn)中，白血病患者接受兩個(gè)臍帶血單位作為干細(xì)胞的替代來源，一個(gè)用dmPGE2處理，另一個(gè)未經(jīng)處理。兩者都被移植到患者體內(nèi)，白細(xì)胞中的DNA多態(tài)性顯示，12名患者中有10名接受dmPGE2治療的臍血中的中性粒細(xì)胞和血小板優(yōu)先植入，接受dmPGE2治療的患者血液植入增強(qiáng)，并且隨后沒有發(fā)生移植物抗宿主病。目前，這種治療方法已成為基因治療試驗(yàn)中處理造血干細(xì)胞的常用方法，它可以改善病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)和干細(xì)胞效應(yīng)。

遺傳性癲癇

Dravet綜合征是一種由SCN1A突變引起的兒童難治性癲癇性腦病。與許多遺傳形式的癲癇一樣，Dravet綜合征沒有明確或令人信服的治療方法。scn1lab功能缺失突變的斑馬魚具有自發(fā)的電圖癲癇發(fā)作和痙攣樣游泳行為，具有兒童Dravet綜合征的臨床特征。此外，與患者一樣，斑馬魚Dravet綜合征模型對(duì)抗癲癇藥物具有抗藥性。

通過對(duì)3000多種市售和FDA批準(zhǔn)的藥物進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)5－HT受體激動(dòng)劑clemizole是scn1lab突變體中自發(fā)癲癇發(fā)作的化學(xué)抑制劑，可抑制痙攣樣行為。EpyGenix Therapeutics目前正在開發(fā)用于臨床的clemizole（EPX－100）和clemizole衍生物（EPX－101、EPX－102和EPX－103）。一期研究證實(shí)，EPX－100是安全的，兒童耐受性良好，EPX－100現(xiàn)已進(jìn)入二期臨床試驗(yàn)，2020年11月首次給藥。

黑色素瘤

斑馬魚黑色素瘤模型對(duì)于理解該疾病的基因組學(xué)和病因?qū)W以及識(shí)別新的治療策略至關(guān)重要。斑馬魚黑色素瘤與人類黑色素瘤具有相同的分子和組織病理學(xué)特征，表明這些模型與黑色素瘤癌癥生物學(xué)和藥物發(fā)現(xiàn)相關(guān)。

黑色素瘤起源于黑素細(xì)胞譜系，即在發(fā)育過程中從神經(jīng)嵴出現(xiàn)的色素細(xì)胞。通過斑馬魚神經(jīng)嵴上的小分子篩選，天然化合物咖啡酸苯乙酯（CAPE）被證明是調(diào)節(jié)神經(jīng)嵴的新型調(diào)節(jié)劑；此外，抗真菌的clotrimazole被證明在KIT轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型中抑制異位黑色素細(xì)胞，并在黑色素瘤細(xì)胞中具有活性。

腺樣囊性癌

腺樣囊性癌（ACC）是一種罕見的惡性頭頸癌，起源于唾液腺。復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性ACC沒有標(biāo)準(zhǔn)的治療手段，大多數(shù)患者在診斷后2年內(nèi)死亡。大多數(shù)ACC具有復(fù)發(fā)性MYB易位，ACC在分子水平上的特征是主轉(zhuǎn)錄因子MYB及其控制增殖和分化的靶基因的過度表達(dá)。

目前很少有實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ涂捎�，培養(yǎng)原代ACC細(xì)胞一直是一個(gè)挑戰(zhàn)。通過使用斑馬魚細(xì)菌人工染色體（BAC）報(bào)告系統(tǒng)，能夠高通量篩選myb－GFP表達(dá)細(xì)胞的調(diào)節(jié)因子。通過重復(fù)篩選3840個(gè)生物活性小分子，發(fā)現(xiàn)全反式維甲酸（ATRA）對(duì)myb–GFP表達(dá)具有有效和選擇性的抑制作用。目前，一項(xiàng)機(jī)構(gòu)發(fā)起的全反式維甲酸二期研究正在進(jìn)行中（NCT03999684），盡管完整的試驗(yàn)結(jié)果尚待確定，但在2021美國癌癥研究協(xié)會(huì)年會(huì)上提交的早期報(bào)告表明，某些患者總體耐受性良好，具有一定的穩(wěn)定作用。

未來方向和展望

藥物發(fā)現(xiàn)仍然是一個(gè)昂貴而費(fèi)力的過程，實(shí)驗(yàn)室和臨床環(huán)境之間的巨大科學(xué)鴻溝阻礙了藥物開發(fā)�？紤]到斑馬魚和人類之間的共同藥物反應(yīng)，斑馬魚可能與哺乳動(dòng)物模型一樣具有強(qiáng)大的臨床前預(yù)測(cè)效果。

斑馬魚和人類之間共有的生理學(xué)特征使斑馬魚成為藥物開發(fā)的重要工具，為新藥物類別打開了大門。斑馬魚正在成為人類癌癥的化身，未來的研究可能進(jìn)一步涉及其他組織和器官之間的跨物種異種移植，用于藥物研究。為了更好地將新的藥物使用從斑馬魚轉(zhuǎn)化到人類，需要進(jìn)一步努力了解斑馬魚體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)。

展望未來的斑馬魚藥物篩選，將多個(gè)篩選參數(shù)納入整個(gè)動(dòng)物篩選將有助于我們了解化學(xué)靶點(diǎn)和藥物治療的反應(yīng)，包括遠(yuǎn)端靶點(diǎn)和非靶點(diǎn)藥物作用。單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)將能夠在大細(xì)胞群體中評(píng)估藥物的影響，提供疾病的細(xì)胞表現(xiàn)以及如何解決疾病的前所未有的細(xì)節(jié)。目前，斑馬魚疾病模型和小分子篩選已經(jīng)展示出令人激動(dòng)的結(jié)果，這也將使斑馬魚為未來的人類疾病治療做出更重大的貢獻(xiàn)。

       原文標(biāo)題 : 藥物發(fā)現(xiàn)中的斑馬魚疾病模型