前言

在過去十年中，我們在提高CAR-T細胞療法的療效方面取得了顯著進展。然而，其臨床益處仍然有限，尤其是在實體腫瘤中。即使在血液腫瘤中，由于多種因素，對CAR-T療法有反應(yīng)的患者仍有復(fù)發(fā)的風(fēng)險。這是由于T細胞特別是CAR-T細胞在癌癥中經(jīng)常出現(xiàn)功能障礙，許多逃避機制損害了抗腫瘤免疫。

與功能失調(diào)的T細胞相比，功能性T細胞在抗原刺激下表現(xiàn)出一系列活性，包括（1）擴增；（2） 分泌效應(yīng)細胞因子（如IL-2、IFN-γ、TNF-α、穿孔素和顆粒酶）并裂解靶細胞；（3） 去除抗原刺激后依然存活；（4）在二次抗原激發(fā)時依然有上述反應(yīng)�？梢哉J(rèn)為，如果以上至少一個標(biāo)準(zhǔn)不符合，T細胞就被認(rèn)為是功能失調(diào)的。

目前，研究最多的T細胞功能失調(diào)狀態(tài)是耗竭，其特征是功能性T細胞的所有上述特性喪失。另一種類型的功能障礙是T細胞衰老，當(dāng)T細胞在保持細胞毒性能力的同時永久性地停止其細胞周期和增殖時，就會發(fā)生衰老。

T細胞功能失調(diào)是CAR-T療法發(fā)展的一個重大障礙，這是從細胞制造步驟開始就遇到的問題。包括CAR的設(shè)計和體外操作以及培養(yǎng)條件，都可能在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，工程化CAR-T細胞以提高其存活率并逆轉(zhuǎn)或防止耗竭表型可能會改善CAR-T細胞的治療。迄今為止，一些研究已經(jīng)采取了一些限制和創(chuàng)造抗耗竭T細胞的方法，并在幾個關(guān)鍵的臨床試驗中進行了測試。這些方法可能改善CAR-T細胞的功能障礙問題，為患者帶來希望。

T細胞耗竭

T細胞耗竭與抗原的持續(xù)驅(qū)動作用息息相關(guān)。在急性感染的狀態(tài)下，幼稚的CD8+T細胞分化為短命效應(yīng)細胞（SLEC）或記憶前體效應(yīng)細胞（MPEC）。在抗原清除后，大多數(shù)SLEC死亡，而MPEC存活形成記憶性CD8+T細胞，形成長期保護性免疫。

而在慢性感染下，觀察到高親和力抗原特異性的CD8+T細胞分化為SLEC迅速清除，死亡，但沒有形成MPEC亞群。相反，針對低抗原親和力的CD8+T細胞擴增、耗竭，表現(xiàn)為增殖、細胞毒性和細胞因子產(chǎn)生的顯著減少，并在對抗持久性抗原的僵持中死亡。

慢性病毒感染和癌癥的一個共同特征就是，兩者都是以抗原的持久性作用為特征的長期疾病。針對腫瘤抗原的幼稚CD8+T細胞首先在外周淋巴組織啟動，產(chǎn)生具有自我更新特性的干細胞樣PD-1loCD8+T細胞，在趨化因子CCL5和CXCL9的作用下，向TME遷移并形成具有效應(yīng)作用的PD-1loCD8+Tex。然而，TME中持續(xù)的抗原負(fù)荷最終迫使這些細胞持續(xù)分化為喪失功能的PD-1hiCD8+Tex。PD-1hi狀態(tài)伴隨著協(xié)同抑制受體表達的增強（包括Tim-3、LAG-3、CD160、2B4、TIGIT和CTLA-4）以及效應(yīng)器功能的逐漸喪失。一旦CD8+Tex進入PD-1hi狀態(tài)，表觀遺傳會強制阻止去分化回到功能性干細胞樣和效應(yīng)器樣PD-1lo狀態(tài)。ICB（例如，抗PD-1）促進的抗腫瘤反應(yīng)僅來自淋巴或腫瘤內(nèi)PD-1loCD8+Tex亞群的擴增，功能低下、ICB抵抗的PD-1hiCD8+Tex最終會凋亡。

腫瘤和慢性病毒特異性CD8+T細胞都具有與TCR信號相關(guān)基因的顯著富集（Batf、Egr2、Ezh2、Irf4、Nfatc1、Nfatc2、Nr4a1、Nr4a2和Nr4a3）。這一觀察結(jié)果進一步證實了抗原的持久性參與是耗竭的主要驅(qū)動因素。

T細胞衰老

細胞衰老是一個典型的多原因過程，發(fā)生在多種細胞類型中，以細胞周期停滯為特征。T細胞衰老和T細胞耗竭是兩個截然不同的過程，衰老細胞表現(xiàn)出特定的衰老相關(guān)分泌表型（SASP），對其他細胞產(chǎn)生旁分泌影響。衰老的T細胞往往表現(xiàn)為CD45RA+CD27−CD28−KLRG1+CD57+表型，它們失去增殖和分泌IL-2的能力，但表達細胞溶解分子、IFN-γ和TNF-α，并在體外具有細胞毒性。

T細胞衰老通常與DNA損傷反應(yīng)（DDR）的激活有關(guān)，DDR由端粒侵蝕、活性氧（ROS）引起的DNA損傷、葡萄糖或生長因子剝奪以及cAMP途徑激活觸發(fā)。衰老T細胞表現(xiàn)出p38活化和活性氧積累增加、線粒體活性受損、mTOR信號下調(diào)和端�？s短。盡管經(jīng)歷了細胞周期阻滯，但這些細胞仍具有細胞毒性，與末端效應(yīng)T細胞相似。

此外，慢性感染或自身免疫性疾病期間的反復(fù)激活也與T細胞衰老有關(guān)。腫瘤誘導(dǎo)的衰老T細胞已被證明可以抑制腫瘤微環(huán)境中其他T細胞的活性。越來越多的證據(jù)表明，腫瘤誘導(dǎo)T細胞衰老是一種逃避機制。

CAR-T細胞功能障礙的機制

經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的CAR-T細胞與未經(jīng)修飾的T細胞表現(xiàn)出類似的功能障礙機制。事實上，從同一荷瘤小鼠分離的CD8+CAR-T細胞和TIL具有相似的轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳學(xué)特征。已知有助于T細胞功能障礙的靶向通路可能改善CAR-T細胞功能。

CAR的設(shè)計

細胞外CAR結(jié)構(gòu)域的類型、連接單鏈抗體與跨膜結(jié)構(gòu)域的間隔區(qū)類型以及構(gòu)成CAR的共刺激結(jié)構(gòu)域已被證明對T細胞功能和持久性有深遠影響。臨床試驗中使用的大多數(shù)CAR來源于小鼠，這可能導(dǎo)致體液和CD8+T細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致免疫排斥。

CAR的親和力影響強直信號，對靶細胞過強的親和力可能導(dǎo)致T細胞耗竭。一項研究開發(fā)了一種CAT-CAR（CD19單鏈抗體），其與CD19的親和力比從傳統(tǒng)的CAR低40倍。該結(jié)構(gòu)在復(fù)發(fā)或難治性兒童BLL患者中進行了測試，臨床研究發(fā)現(xiàn)，14例CAR-T細胞擴增增加的患者中有11例表現(xiàn)出持續(xù)性。

此外，共刺激域在CAR-T細胞的持久性和有效性中也起著關(guān)鍵作用，共刺激分子包括CD28、ICOS、CD27、4-1BB、OX40和CD40L。幾項研究發(fā)現(xiàn)，配備4-1BB結(jié)構(gòu)域而非CD28結(jié)構(gòu)域的CAR結(jié)構(gòu)中的T細胞持久性增強。其他研究報告，含有4-1BB的CAR-T細胞顯示出增強的記憶T細胞（TEM）表型，這可能延遲CAR-T細胞耗竭。ICOS屬于CD28共刺激分子家族，研究證明，CAR結(jié)構(gòu)中ICOS和4-1BB共刺激結(jié)構(gòu)域的組合顯著增加T細胞的持久性。這些觀察結(jié)果表明，共刺激域的結(jié)構(gòu)是影響CAR-T細胞持久性的重要因素。

體外操作

制造T細胞的過程需要從患者身上獲取足夠數(shù)量的健康T細胞。然而，可能在從老年患者或經(jīng)化療/全身照射預(yù)處理的患者獲得衰老的T細胞。尤其是那些含有氯法拉濱或阿霉素的化療，導(dǎo)致淋巴細胞減少會使最終的CAR-T細胞質(zhì)量不理想，用于輸注的T細胞類型嚴(yán)重影響治療的效果。

事實上，通過使CD4/CD8比率正常化或使用幼稚或記憶細胞亞群，在臨床前模型中獲得了更好的持久性。幾項研究表明，使用早期譜系細胞富集的T細胞群能夠更好地擴增，并提高CAR-T細胞治療的持久性和療效。此外，多項研究表明，在制造過程中向細胞培養(yǎng)物中添加抗氧化劑，如N-乙酰半胱氨酸，也可抑制效應(yīng)器分化并促進TSCM細胞的擴增。

免疫抑制微環(huán)境

在TME中，髓源性抑制細胞（MDSC）、癌相關(guān)成纖維細胞（CAF）和腫瘤細胞產(chǎn)生的免疫抑制細胞因子的存在會導(dǎo)致T細胞耗竭。

慢性暴露于抗原也可導(dǎo)致T細胞衰竭，如果抗原刺激持續(xù)存在，T細胞會發(fā)生一系列表觀遺傳、代謝和轉(zhuǎn)錄改變，出現(xiàn)耗竭狀態(tài)的表征。這種過程以遞進的方式發(fā)生，IL-2和TNF-α在早期丟失，IFN-γ和趨化因子分泌在耗竭進展后期減少。盡管高增殖能力也在早期喪失，但在體內(nèi)受到刺激時，耗竭的T細胞仍能有限增殖。耗竭的細胞也表現(xiàn)出抑制性受體的高表達，如PD-1、TIM-3、LAG-3、CD160、BTLA、CTLA-4和TIGIT。

改善CAR-T細胞功能障礙的策略

表達細胞因子及其受體

第四代CAR T細胞最近被開發(fā)出來，用于抵抗TME中的免疫抑制環(huán)境，同時克服免疫耗竭。TRUMKS設(shè)計將CAR-T細胞的細胞毒性功能與具有免疫調(diào)節(jié)能力的細胞因子的原位遞送結(jié)合起來。在誘導(dǎo)系統(tǒng)的作用下，在CAR結(jié)合抗原后，細胞因子被合成，并以自分泌方式發(fā)揮作用，以增加T細胞的存活和擴增。細胞因子也可以旁分泌方式發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)周圍環(huán)境，干擾TME中存在的免疫抑制細胞因子。包括IL-12、IL-7、IL-15、IL-18、IL-21和IL-23在內(nèi)的一系列細胞因子目前正在研究中，并已進入早期臨床試驗階段。

IL-12是一種促炎癥細胞因子，可誘導(dǎo)Th1CD4+T細胞反應(yīng)，促進CD8+克隆擴增和持續(xù)存在。它還負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)CTL和自然殺傷（NK）細胞的細胞毒性活性，重新激活無能的腫瘤浸潤淋巴細胞，招募NK細胞，并抑制Treg。對結(jié)構(gòu)性表達IL-12的CD19-CAR-T細胞的臨床前研究表明，它增強了腫瘤殺傷效果和針對癌癥抗原的免疫記憶。然而，與IL-12相關(guān)的潛在致命毒性使得有必要開發(fā)一種誘導(dǎo)系統(tǒng)，僅在CAR激活時限制IL-12的分泌。一些臨床研究（NCT02498912、NCT03932565和NCT03542799）正在進行和招募中。

IL-15是一種刺激CD8+T細胞和NK細胞活化、增殖和細胞毒性活性的細胞因子。IL-18增加Th1細胞細胞因子的產(chǎn)生，同時抑制IL-10的合成。IL-15和IL-18都是免疫反應(yīng)的增強劑，已經(jīng)在CAR-T細胞上進行了測試。與傳統(tǒng)的CAR-T細胞相比，分泌IL-18和IL-15的CAR-T細胞在荷瘤小鼠中顯示出增強的擴張性和持久性，并且在體外和體內(nèi)顯示出增強的腫瘤細胞毒性。目前正在招募多項臨床試驗，使用工程化T細胞和NK細胞測試IL-15和IL-18分泌的CAR在實體瘤和血液瘤中的作用。

最近的研究表明，在同一個CAR-T細胞中共同表達多種細胞因子是可能的。NCT04833504是最近完成的一項臨床試驗，其中在復(fù)發(fā)或難治性B細胞淋巴瘤患者中檢測表達IL-7和CCL19的CD19+CART細胞，但結(jié)果尚未報道。目前正在招募另外兩項臨床試驗，以檢測表達IL-7的CAR-T細胞與PD-1阻斷劑或其他細胞因子的分泌相結(jié)合。

聯(lián)合檢查點阻斷療法

通過抑制檢查點信號減少耗竭的策略包括通過shRNA表達載體或CRISPR/Cas9敲除共抑制分子。許多研究報告，阻斷檢查點抑制可恢復(fù)細胞因子的產(chǎn)生并促進CAR-T細胞存活。此外，同時阻斷多個免疫檢查點，如PD-1、TIM-3和LAG-3，可協(xié)同增加CAR-T細胞的效應(yīng)器功能。

將CAR-T細胞與免疫檢查點阻斷療法相結(jié)合可能是增強抗腫瘤活性、持久性和記憶細胞形成的有效策略。在膠質(zhì)母細胞瘤和乳腺癌細胞系中，抗PD-1抗體增強了抗HER2 CAR-T細胞的抗腫瘤活性。然而，一些臨床試驗報告，在使用PD-1抑制劑和抗GD2 CAR-T細胞聯(lián)合治療神經(jīng)母細胞瘤患者后，結(jié)果為陰性。

此外，一些研究已經(jīng)采用其他策略來阻斷PD-1，例如基因編輯以使CAR-T細胞分泌PD-1阻斷抗體或下調(diào)PD-1。

使用干性T細胞

效應(yīng)T細胞最初被認(rèn)為是ACT的最佳產(chǎn)品，因為它們具有殺死腫瘤細胞的功效。然而，它們的持久性有限，并且擴增能力很差，很容易發(fā)生耗竭。

TSCM由于其壽命長、自我更新能力強以及在不同T細胞群中的分化能力，是ACT的理想候選。臨床研究表明，輸注表型和功能性TSCM樣CAR-T細胞（CD62L+、CD28+和CD27+）可產(chǎn)生良好的結(jié)果。例如，使用抗CD-19 CAR-T細胞治療的CLL和多發(fā)性骨髓瘤患者顯示出與CD27+CD45RO−CD8細胞群相關(guān)的良好反應(yīng)。此外，對小鼠的研究表明，注入富含CD62L+的T細胞群可增加擴增和持久性，從而導(dǎo)致持久的腫瘤消退。

小結(jié)

盡管在過去十年中CAR-T細胞治療取得了顯著進展，然而CAR-T細胞在患者體內(nèi)可能發(fā)生的功能障礙導(dǎo)致有限的持久性依然是一個挑戰(zhàn)，主要原因是T細胞耗竭和衰老。通過對CAR結(jié)構(gòu)設(shè)計，改變生產(chǎn)條件，或引入新的治療方法，我們可能創(chuàng)造抗耗竭的工程化T細胞，從而進一步擴大CAR-T細胞的臨床應(yīng)用。盡管迄今為止的結(jié)果仍然有限，但可能性是無窮的，突破可能即將到來。 

參考文獻：

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       原文標(biāo)題 : CAR-T細胞功能障礙的改善策略